紫菀萜类合成相关代谢物和基因筛选及MPS基因克隆

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紫菀(Astertataricus L.f.)是菊科紫菀属多年生草本植物,干燥根和根茎是临床常用祛痰止咳中药材,目前关于紫菀的研究有种质资源评价、化学成分开发、药理药性鉴定等,对紫菀根部不同时期代谢物差异和基因表达情况的研究仍未有报道。植物生长发育过程中基因调控网络复杂,代谢物变化多样,基因与代谢物的相关联合分析是构建植物核心网络的重点。随着转录组高通量测序技术及代谢组技术的成熟与发展,逐渐成为学者科学研究的技术手段首选,为早日解析紫菀药用成分生物合成途径和表达调控工作提供可靠的技术支持。祁紫菀是河北道地中药材,根粗且长,质柔韧,紫菀酮含量可达0.32%,浸出物含量可达63%,均远高于《中华人民共和国药典》规定的标准。因此开展祁紫菀中化学成分研究及合成代谢相关基因的筛选和验证对于解析其代谢途径具有重要意义。本研究以祁紫菀为材料,测定了不同发育时期根部紫菀酮含量变化趋势,选定紫菀酮含量峰值期及前后各两个时期的根系进行转录组和代谢组联合分析,挖掘和鉴定了不同时期根部差异代谢成分及差异表达基因,为探究紫菀萜类合成机理和提高紫菀酮含量奠定基础。主要研究结果如下:(1)明确了祁紫菀中紫菀酮含量的时空变化趋势。对紫菀9个发育时期的五个部位进行了紫菀酮含量测定,结果表明紫菀酮含量在整个生长期处于动态变化状态,根部及根状茎中紫菀酮含量显著高于其他部位。不同时期根部紫菀酮变化趋势为升-降-升,自5月(0.15%)起紫菀酮含量持续上升,10月中旬紫菀酮含量达到峰值(0.32%),之后略有下降,来年返青前处于上升趋势,含量达到0.28%。根状茎中紫菀酮含量在整个发育时期一直处于上升趋势,第二年返青前含量达到最高(0.15%)。芦头中紫菀酮含量在10月中旬前不断增加,之后基本保持不变(0.09%)。叶片中紫菀酮含量在9月中旬前不断上升,之后持续下降。叶柄中几乎没有紫菀酮积累。(2)分析了祁紫菀五个发育时期(T1-T5)的根部转录组数据。共获得125.56Gb数据,631 853条transcript,平均长度为798 bp,Unigene 505 334条,平均长度为929 bp,通过比对,全部Unigene获得基因注释信息。差异组合T1 VS T2、T1 VS T3、T1 VS T4、T1 VS T5分别确定了差异表达基因23012个(上调10269个和下调12734个)、26789个(上调16925个和下调9864个)、32694个(上调20544个和下调12150个)、37903个(上调21264个和下调16639个);GO注释富集结果表明差异表达基因被分为3个类别,包括细胞组分类别,分子功能类别,生物过程类别,代谢过程、刺激应答、催化活性等条目显著聚集,KEGG注释富集分析结果表明7178(T1 VS T2)、8247(T1 VS T3)、9805(T1 VS T4)、12155(T1VS T5)个差异表达基因分别被分配到143、143、141、141条KEGG通路,所有的代谢途径可以分为六类:代谢,细胞过程,环境信息加工,基因信息加工,人类疾病和生物系统,其中32、47、40、45条路径分别显著富集,大致可以归为糖类代谢、萜类合成、黄酮类生物合成、蛋白质合成及加工四类。(3)鉴定了祁紫菀五个发育时期(M1-M5)的根部代谢产物并进行了差异分析。共鉴定出523种代谢物,包括酚酸类108种、黄酮类80种、脂质64种、氨基酸及其衍生物60种、核苷酸及其衍生物42种、有机酸38种、生物碱33种、脂素和香豆素13种、鞣质1种、萜类8种及其他类76种;黄酮类可以进一步分为二氢黄酮、二氢黄酮醇、花青素等,其他类可以细分为口山醇、糖及醇类、维生素等,生物碱进一步分为苯丙胺类生物碱、酚胺、异喹啉类生物碱等,萜类分为倍萜和三萜,脂质分为甘油酯、鞘脂等。四个时期差异比较组中125(M1 VS M2)、190(M1 VS M3)、270(M1 VS M4)、235(M1 VS M5)种差异代谢物分别被分配到47、72、77、72条KEGG通路,所有的代谢途径可以分为四类:代谢、环境信息加工、基因信息加工和人类疾病,各差异比较组差异代谢物富集的通路可以归为糖类代谢及转换、氨基酸降解及生物合成和黄酮类生物合成三类。(4)代谢组与RNA-seq联合分析富集了与紫菀萜类化合物合成密切相关的代谢途径,初步筛选了差异表达基因及相关差异代谢物。差异表达基因及差异代谢物同时富集的通路有:组合M1 VS M2、T1 VS T2中,次生代谢物合成(ko00110),组合M1 VS M3、T1 VS T3中,精氨酸和脯氨酸代谢(ko00330)、半乳糖代谢(ko00052)、葡萄糖和戊糖醛酸转换(ko00040),组合M1 VS M4、T1 VS T4中,葡萄糖和戊糖醛酸转换(ko00040)、花青苷生物合成(ko00942)、亚油酸代谢(ko00591),组合M1 VS M5、T1 VS T5中,花青苷生物合成(ko00942)。乙醛脱氢酶、鸟氨酸转氨酶、多胺氧化酶等与精氨酸和脯氨酸代谢显著相关,α-葡萄糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶等与半乳糖代谢显著相关,果胶脂酶、UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase、6-磷酸葡糖酸脱氢酶等与戊糖醛酸转换显著相关,乙酰转移酶、花青苷丙二酰转移酶与花青苷合成显著相关。(5)克隆了紫菀中萜类骨架合成候选基因1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-磷酸合酶(1-hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-phosphate synthase,MPS)并进行了生物信息学分析。结果表明MPS全长1542bp,蛋白质结构具有特殊二级结构α螺旋、延伸链、β转角及无规则卷曲,编码514个氨基酸,其编码蛋白无信号肽,预测分析结果表明酶MPS氨基酸序列理论等电点为5.91,呈弱酸性,正负电荷比例为67:78,蛋白中亮氨酸含量最高,达到11.8%,相对分子质量为63450.02,平均亲水系数为负值-0.172,属亲水性蛋白,不稳定指数(Ⅱ)为38.93,为稳定性蛋白,1个跨膜结构、4个功能结构域,与目的基因亲缘关系最近的为黄花蒿的(E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase。综上所述,祁紫菀根部所有Unigne通过各数据库比对得到注释,鉴定到523种代谢物,丰富并完善了紫菀根部化学成分研究工作;不同时期差异代谢物与相关差异表达基因有显著差异性与显著相关性;根据紫菀酮合成变化趋势初步筛选出大量与紫菀萜类合成相关的候选基因及差异代谢物信息;基因与代谢物共同显著富集到的KEGG通路选为重点关注通路,萜类骨架合成途径是萜类物质合成的关键通路,候选基因MPS与紫菀酮变化趋势一致并取得了基因CDS序列,为后续基因功能验证奠定了可靠基础。
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