【摘 要】
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水稻草状矮化病毒（Rice grassy stunt virus,RGSV）为纤细病毒属（Tenuivitrus）的成员,经褐飞虱以持久增殖的方式传播。RGSV 6条RNA链均采用双义编码策略,编码12个蛋白。RGSV首次在菲律宾发现,而后在越南、印度尼西亚等东南亚国家大面积暴发,接着在我国沿海省份也不断发生,给水稻生产造成重大损失。RGSV感染水稻导致病株明显矮化,分蘖增多似草状,叶片黄化,后期
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水稻草状矮化病毒（Rice grassy stunt virus,RGSV）为纤细病毒属（Tenuivitrus）的成员,经褐飞虱以持久增殖的方式传播。RGSV 6条RNA链均采用双义编码策略,编码12个蛋白。RGSV首次在菲律宾发现,而后在越南、印度尼西亚等东南亚国家大面积暴发,接着在我国沿海省份也不断发生,给水稻生产造成重大损失。RGSV感染水稻导致病株明显矮化,分蘖增多似草状,叶片黄化,后期会形成不规则的暗褐色或锈色小斑。但目前对其症状形成的分子机制尚不明确。热激蛋白（Heat shock protein,Hsp）是存在于所有生物体内的一类抵抗逆境胁迫且高度保守的分子伴侣蛋白质,OsDnaJ/Hsp40作为小分子热激蛋白的一种,参与了很多病毒的侵染、复制和运动等致病过程,Satoh等（2013）利用转录组测序分析发现,RGSV侵染水稻后抑制了 Hsp40（即OsDnaJ）基因的表达。据报道,RGSV的p2蛋白为沉默抑制子（VSR）,以p2为诱饵蛋白,筛选日本晴水稻的cDNA文库,得到一个水稻Hsp40/DnaJ蛋白。本研究通过酵母双杂交、双分子荧光互补、沉默抑制子活性鉴定、PVX致病性分析、农杆菌介导的水稻遗传转化体系、转基因水稻传毒等实验,探究OsDnaJ基因在RGSV侵染过程中的作用机制,为研究RGSV侵染水稻的作用机理提供理论基础。研究结果如下:1、酵母双杂交和BiFC分别验证了 p2与OsDnaJ互作,将OsDnaJ根据其二级结构分成4段,构建OsDnaJ的9个缺失突变体,运用酵母双杂交技术鉴定OsDnaJ的互作区域,结果表明:OsDnaJ的互作区域在80到120个氨基酸之间,该区域的二级结构为一段β折叠。在本氏烟细胞中,p2与OsDnaJ亚细胞定位实验表明:RGSV的p2定位于细胞核,大部分OsDnaJ定位于叶绿体,二者共定位后发现部分OsDnaJ会聚集在p2的周围或者与p2共定位。2、将转化携带 pEarleyGate100-OsDnaJ 和 pEarleyGate100-p2 的农杆菌分别与携带35S-ssGFP载体的农杆菌按3:1混合注射16c转基因烟草,以及按OsDnaJ:p2:ssGFP=3:3:1的比例混合注射16c,结果表明:p2的沉默抑制子活性较弱,OsDnaJ无沉默抑制子活性,但OsDnaJ能够增强p2的沉默抑制子活性。3、PVX致病性实验表明:p2和OsDnaJ能够增强马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）对本氏烟的致病性,且PVX-OsDnaJ对本氏烟的致病程度比PVX-p2更严重。4、转基因水稻传毒实验表明:30 dpi时,与接种RGSV的健康日本晴相比,超表达OsDnaJ和p2的转基因水稻RGSV病毒含量分别上调2倍和6.9倍,RNAi干扰OsDnaJ和p2的转基因水稻RGSV病毒含量分别下调2.5倍和27.2倍。5、BiFC 实验表明:OsDnaJ 也可以与 RSV-NS3、CMV-2b、BaMV-TGBP1、TuMV-HCPro、TYLCCNV-βC1 等 VSRs 互作。基于以上的研究结果,我们推测OsDnaJ参与了 RGSV的致病机制,而且可以进一步研究OsDnaJ在RGSV致病过程中的功能。
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