乙型肝炎病毒(HBV)严重危害人类公共健康。在我国，HBV的感染率约10％，现患慢性乙型肝炎约3000万人。HBV的感染不仅能够引起急、慢性病毒性肝炎，而且部分感染者会发生肝硬化和肝细胞癌。病毒的基因变异与逃避机体免疫应答、出现耐药性、改变致病性和引起疾病流行等有关。研究病毒基因变异对防治HBV感染有重要意义。乙型肝炎病毒s基因编码的HBsAg是乙肝疫苗的主要成分，也是诊断HBV感染的重要依据。抗-HBs抗体可用来预防肝移植后HBV的再感染，但有赖于HBsAg与抗-HBs抗体之间的相互作用。因此，HBsAg抗原性的变化可直接影响HBV感染后的诊断和治疗。目前所知s基因突变发生率最高的部位是表面抗原中第145位氨基酸(s基因nt587 G→A)的甘氨酸→精氨酸的突变(G145R)。这种新的变异株可导致疫苗免疫失败、抗-HBs预防移植后HBV肝脏再感染和母婴垂直传播等，给乙肝防治带来了新的问题。因此，有必要开发针对这一变异株的疫苗，以及对变异给HBV生物学性状带来的改变进行深入的研究。另外，由于乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒，宿主范围狭窄，在自然情况下，只能感染人和高等灵长类动物，不能感染医学科学研究中常用的实验哺乳动物，如小鼠一类的啮齿类动物，并且体外细胞培养系统又只能进行体外研究，因而很大程度上限制了乙肝变异研究的深入。建立G145R变异株的转基因小鼠可为全面研究变异对HBV抗原性、免疫原性和致病性的改变以及抗HBV变异株药物筛选和临床相关疾病的治疗提供理想的动物模型。我们构建了HBVs基因(nt587 G→A)变异株G145R的真核表达载体pCMV-S2.S+145R(PR)并对其进行酶切鉴定和DNA序列测定。通过体外表达和免疫正常小鼠，探讨变异所致乙肝表面抗原免疫学性状的改变。研究发现，将其转染HepG2细胞后第3天，培养上清中用EIA法检测HBsAg呈阳性，OD值随时间延长而上升，但与野生型(PS)相比OD值明显低。PR与PS转染细胞的HBsAg细胞免疫化学检测均有部分细胞呈阳性，但差别不显著。PR免疫小鼠可诱导其产生抗-HBs及抗-HBs2，并且抗-HBs2的出现早于抗-HBs约1～2周。但有效保护抗体滴度的出现晚于PS组约1～2周，抗-HBs平均抗体滴度也低于PS组。抗-HBs2的平均抗体滴度二组无显著差别。采用51铬释放实验检测淋巴细胞杀伤功能，发现PR免疫的小鼠脾淋巴细胞具有很强的HBV特异杀伤功能。上述结果说明，PR的表达产物具有第二军医大学硕士论文中文摘要良好的抗原性，能够与抗一HBs结合，但与野生型相比结合力明显降低;虽然:基因的变异改变了PR的抗原性与免疫原性，但PR能够诱导C57BL/6小鼠产生强大的体液免疫和细胞免疫应答。 为进一步研究变异在全基因水平对HBV免疫学性状的影响和为鉴定PR对HBVG145R变异株的治疗效果，本研究还用变异s基因(ni587G一A)的1.2拷贝的adr型HBV全基因组DNA片段(G 1 45R变异株)，通过显微注射法导入小鼠受精卵，获得了乙型肝炎病毒变异株转基因小鼠Founder。以PCR、Southem一blot、ELISA、组织切片HE染色、免疫组织化学、透射电镜等方法，分析所导入基因在小鼠基因组中整合、表达和复制情况。将血清HBsAg阳性的小鼠继续传代，并对其进行检测。结果发现，显微注射397枚卵，产仔49只，存活43只，其中有26只鼠尾组织DNA PCR检测阳性，2只在血清中检测到HBsAg和HBeAg，16只在肝细胞质有HBsAg的表达及细胞质或胞核有HBcAg的表达;血清学阳性的两只Founder小鼠，分别命名为C57一TgN(月刃vadrl.2)G145R、1#和2#。1#Founder小鼠FI代共一6只，其中鼠尾组织DNA PcR阳性12只，血清HBsAg阳性7只，肝组织活检免疫组化HBsAg和HBcAg阳性10只。2# Founder小鼠Fl代共8只，其中7只出生后死亡或为死胎仅一只存活，其鼠尾组织DNA PCR、血清HBsAg、肝活检组织免疫组化HBsAg和HBcAg均为阳性。鼠尾组织DNA进行Southem一bfotting检测Founder及部分F1代均为阳性。这说明，我们成功建立了乙型肝炎病毒变异株转基因小鼠C57一TgN(HBvadr了.2)G145R，HBV基因组DNA己经整合至小鼠的基因组，功能基因能够表达，整个基因组DNA能复制，被有效地包装、分泌，并且能够稳定遗传给子一代。 为探讨PR治疗HBV G145R变异株感染的可行性，本研究将PR免疫C57一TgN(月万vadrl.2)G145R HBV全基因组转基因小鼠后发现，PR能够诱导转基因小鼠产生抗一HBs及抗一HBsZ，并且抗一HBsZ的出现早于抗一HBs约1一2周。PR免疫sw后，转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg为阴性;6周后，肝脏活检组织免疫组织化学检测HBsAg和HBcAg也为阴性。肝脏组织出现类似人类急性肝炎病理改变，免疫前后单个核淋巴细胞浸润无显著变化。这说明，PR能够逆转转基因小鼠的免疫耐受，有效诱导HBV特异性的体液免疫应答，能够清除转基因小鼠血清中的HBsAg和HBeAg，抑制肝细胞的HBsAg和HBcAg表达。