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短梗五加(Acanthopanax sessiliflorus)作为一种重要的传统中药-东五加皮的重要药源，在我国拥有着悠久的药用和食用历史。截止目前，国内关于短梗五加的研究多集中在栽培技术和茎皮根皮的化学成分及药理活性方面。此外，尽管短梗五加全株已被国家批准为可用于饮料生产的新食品原料，但在饮料生产过程中，由于其叶片苦，口感差，往往不被应用。课题组前期在探索短梗五加叶苦味物质的过程中发现，短梗五加叶中含有以chiisanoside为代表的大量的裂环羽扇豆烷型三萜皂苷，并发现其具有很好的抗肿瘤和抗急性肝损伤活性。本文在前期研究的基础上，进一步探讨了短梗五加叶中系列裂环羽扇豆烷型三萜皂苷的制备方法，及其抗炎、抗急性肝损伤、抗肿瘤活性及初步构效关系，为短梗五加叶的开发利用提供依据。主要研究内容及结果如下：
(1)短梗五加叶裂环羽扇豆烷型三萜的提取分离及转化工艺研究
采用70%乙醇超声提取，D101大孔吸附树脂分离纯化，从短梗五加叶中制备了短梗五加叶裂环羽扇豆烷型三萜皂苷有效部位。采用硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为流动相进行分离，半制备高效液相色谱对有效部位中的三萜类成分进行了进一步的纯化，得到5个单体，分别为：chiisanoside(CSS)、divaroside(DVS)、sessilside-A1(SSA)、sessiligenin(SSG)、chiisanogenin(CSG)，其中，除CSS含量较高以外，其余均为稀有天然产物。并经过有机波谱方法学对以上化合物的结构进行了解析，其中SSG为首次分离获得的新化合物。同时，采用碱水解法，实现了植物体外各有效成分间的转化，使得各稀有皂苷及苷元能够被开发和利用。
(2)对脂多糖(LPS)诱导的raw264.7细胞炎症影响研究
利用LPS诱导raw264.7细胞炎症模型，探讨系列裂环羽扇豆烷型三萜抗炎活性及构效关系。小鼠巨噬细胞raw264.7用1μg/mLLPS处理24h后，采用CCK-8法检测各给药组细胞活力；收集培养基离心后检测培养物上清中一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)水平；Westernblot蛋白印迹法检测细胞内环氧合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达量。结果表明：CSS、DVS、SSA、SSG、CSG对raw264.7细胞均未表现出明显的毒副作用；同时，等摩尔浓度的CSS、DVS、SSA、CSG、SSG随着分子结构上糖链的断开和内酯环的打开，对NO和PGE2抑制作用呈逐渐增强的趋势；此外Westernblot检测结果表明CSS、DVS、SSA、CSG、SSG对COX-2和iNOS的表达也有着同样的抑制效果。这些结果表明CSS、DVS、SSA、CSG、SSG具有较强的抗炎活性，其构效关系与化合物分子大小及内酯环有关。
(3)抗CCl4诱导的急性肝损伤作用研究
利用CCl4诱导的急性肝损伤模型探究了上述裂环羽扇豆烷型三萜的抗肝毒性作用。小鼠连续灌胃给药7天，并在末次给药1h后，腹腔注射CCl4(0.2%)，24h后收集小鼠全血和肝脏。根据试剂盒说明检测血清和肝脏相关理化指标；H&E染色观察组织病理学变化；Westernblot蛋白印迹法检测细胞内COX-2和iNOS蛋白表达量。结果表明，和CCl4组相比，DVS、SSA、CSG、SSG显著降低了血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平；提高了肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)，降低了丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平；H&E染色表明DVS、SSA、CSG、SSG能够改善CCl4诱导的炎性浸润现象；此外，Westernblot检测发现DVS、SSA、CSG、SSG显著下调了COX-2和iNOS蛋白的表达。综上所述，DVS、SSA、CSG、SSG能够有效降低了CCl4造成的肝毒性，而CSS几乎没有作用，其构效关系与化合物分子大小及内酯环有关。
(4)对HepG2细胞增殖及凋亡的影响及机制研究
以HepG2细胞为对象研究体外细胞毒作用。首先测试CSS、DVS、SSA、CSG、SSG对肝癌HepG2细胞和正常肝细胞L02细胞增殖的影响；计算机模拟分子对接、Hoechst33258荧光染色、AnnexinV-FITC/PI染色、RT-PCR、Westernblot分析细胞凋亡机制。结果表明，SSG体外抑制HepG2细胞增殖、促进凋亡作用最明显；同时，Westernblot检测结果表明SSG能够显著下调p-PI3K、p-AKT、Bcl-2水平，上调Bax表达量；RT-PCR检测结果表明SSG能够显著上调Bax，下调Bcl-2、caspase-3、caspase-9水平。综上所述，SSG表现出较好的对HepG2肝癌细胞体外抗细胞增殖活性，并通过多靶点调控PI3K/AKT信号转导通路诱导HepG2细胞凋亡。
(5)对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究
建立H22荷瘤小鼠动物模型，给药14天后，取血、收集肿瘤组织及各脏器组织并称重，计算抑瘤率和器官指数；检测血清ALT、AST、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、TNF-α、IL-2、干扰素-γ(IFN-γ)、血管内皮生长因子(VEGF)水平；H&E染色观察组织病理学变化。结果表明，CSS、DVS、SSA、CSG、SSG均能有效抑制肿瘤生长，其中SSG抑瘤率最高可达73.77%，高于阳性药环磷酰胺(CTX)的66.39%；与模型组相比，给药组小鼠血清ALT、AST、CRE、BUN和VEGF显著降低，而TNF-α、IL-2、IFN-γ显著上升；病理切片观察到给药组肿瘤细胞相较于模型组出现明显的凋亡现象。综上所述，CSS、DVS、SSA、CSG、SSG均能有效抑制H22移植瘤的生长，其中SSG整体表现最强。
(1)短梗五加叶裂环羽扇豆烷型三萜的提取分离及转化工艺研究
采用70%乙醇超声提取，D101大孔吸附树脂分离纯化，从短梗五加叶中制备了短梗五加叶裂环羽扇豆烷型三萜皂苷有效部位。采用硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为流动相进行分离，半制备高效液相色谱对有效部位中的三萜类成分进行了进一步的纯化，得到5个单体，分别为：chiisanoside(CSS)、divaroside(DVS)、sessilside-A1(SSA)、sessiligenin(SSG)、chiisanogenin(CSG)，其中，除CSS含量较高以外，其余均为稀有天然产物。并经过有机波谱方法学对以上化合物的结构进行了解析，其中SSG为首次分离获得的新化合物。同时，采用碱水解法，实现了植物体外各有效成分间的转化，使得各稀有皂苷及苷元能够被开发和利用。
(2)对脂多糖(LPS)诱导的raw264.7细胞炎症影响研究
利用LPS诱导raw264.7细胞炎症模型，探讨系列裂环羽扇豆烷型三萜抗炎活性及构效关系。小鼠巨噬细胞raw264.7用1μg/mLLPS处理24h后，采用CCK-8法检测各给药组细胞活力；收集培养基离心后检测培养物上清中一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)水平；Westernblot蛋白印迹法检测细胞内环氧合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达量。结果表明：CSS、DVS、SSA、SSG、CSG对raw264.7细胞均未表现出明显的毒副作用；同时，等摩尔浓度的CSS、DVS、SSA、CSG、SSG随着分子结构上糖链的断开和内酯环的打开，对NO和PGE2抑制作用呈逐渐增强的趋势；此外Westernblot检测结果表明CSS、DVS、SSA、CSG、SSG对COX-2和iNOS的表达也有着同样的抑制效果。这些结果表明CSS、DVS、SSA、CSG、SSG具有较强的抗炎活性，其构效关系与化合物分子大小及内酯环有关。
(3)抗CCl4诱导的急性肝损伤作用研究
利用CCl4诱导的急性肝损伤模型探究了上述裂环羽扇豆烷型三萜的抗肝毒性作用。小鼠连续灌胃给药7天，并在末次给药1h后，腹腔注射CCl4(0.2%)，24h后收集小鼠全血和肝脏。根据试剂盒说明检测血清和肝脏相关理化指标；H&E染色观察组织病理学变化；Westernblot蛋白印迹法检测细胞内COX-2和iNOS蛋白表达量。结果表明，和CCl4组相比，DVS、SSA、CSG、SSG显著降低了血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平；提高了肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)，降低了丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平；H&E染色表明DVS、SSA、CSG、SSG能够改善CCl4诱导的炎性浸润现象；此外，Westernblot检测发现DVS、SSA、CSG、SSG显著下调了COX-2和iNOS蛋白的表达。综上所述，DVS、SSA、CSG、SSG能够有效降低了CCl4造成的肝毒性，而CSS几乎没有作用，其构效关系与化合物分子大小及内酯环有关。
(4)对HepG2细胞增殖及凋亡的影响及机制研究
以HepG2细胞为对象研究体外细胞毒作用。首先测试CSS、DVS、SSA、CSG、SSG对肝癌HepG2细胞和正常肝细胞L02细胞增殖的影响；计算机模拟分子对接、Hoechst33258荧光染色、AnnexinV-FITC/PI染色、RT-PCR、Westernblot分析细胞凋亡机制。结果表明，SSG体外抑制HepG2细胞增殖、促进凋亡作用最明显；同时，Westernblot检测结果表明SSG能够显著下调p-PI3K、p-AKT、Bcl-2水平，上调Bax表达量；RT-PCR检测结果表明SSG能够显著上调Bax，下调Bcl-2、caspase-3、caspase-9水平。综上所述，SSG表现出较好的对HepG2肝癌细胞体外抗细胞增殖活性，并通过多靶点调控PI3K/AKT信号转导通路诱导HepG2细胞凋亡。
(5)对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究
建立H22荷瘤小鼠动物模型，给药14天后，取血、收集肿瘤组织及各脏器组织并称重，计算抑瘤率和器官指数；检测血清ALT、AST、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、TNF-α、IL-2、干扰素-γ(IFN-γ)、血管内皮生长因子(VEGF)水平；H&E染色观察组织病理学变化。结果表明，CSS、DVS、SSA、CSG、SSG均能有效抑制肿瘤生长，其中SSG抑瘤率最高可达73.77%，高于阳性药环磷酰胺(CTX)的66.39%；与模型组相比，给药组小鼠血清ALT、AST、CRE、BUN和VEGF显著降低，而TNF-α、IL-2、IFN-γ显著上升；病理切片观察到给药组肿瘤细胞相较于模型组出现明显的凋亡现象。综上所述，CSS、DVS、SSA、CSG、SSG均能有效抑制H22移植瘤的生长，其中SSG整体表现最强。