研究目的：异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治愈恶性血液病和某些恶性肿瘤、免疫以及遗传性疾病的重要医疗手段。但是，传统的造血干细胞移植一般在大剂量的放疗与免疫抑制剂的预处理后才能进行。然而预处理相关的毒性反应及移植后GVHD、排斥、感染等并发症严重限制了allo-HSCT的疗效。相较于传统的清髓方案，非清髓等减低毒性的方案虽然极大程度的降低了预处理相关并发症的发生，但预处理本身所包含的放化疗、移植后免疫抑制剂的应用，以及患者免疫力低下所致的细菌、真菌及病毒等严重感染仍然夺走了许多人的生命。从既往患者治疗过程中发现，造血干细胞一过性植入，能够起到支持造血的作用，而GVHD的发生与供者造血干细胞在受者体内的植入比例及受者的免疫状态有着密不可分的关系，因此，如何使造血干细胞在受者体内短时间、低比例植入，起到促进受者自身造血恢复，同时避免GVHD的发生成为了我们关注的焦点。于是，本研究所在国际上原创性的提出了“微移植”的新理念，微移植不对受者进行致死性或亚致死性免疫抑制和预处理，也不要形成供体细胞完全或混合植入，而仅通过极微量的免疫抑制预处理、形成微量供者嵌合体。此与传统移植预处理和免疫耐受的理念和观念不同。本课题旨在探讨微移植对化疗后H-2半相合小鼠造血功能的影响，为微移植的临床应用提供动物实验基础和理论依据。研究内容：研究在实施微移植条件下，输注不同数量（1×10~78×10~7）的H-2半相合供体细胞后小鼠外周血象、供体植入与GVHD情况，并主要探讨微移植对H-2半相合小鼠外周血象，骨髓集落形成情况及脾脏的影响情况。研究方法：1.化疗剂量：68周雌性CB6F1小鼠给予大剂量Ara-C腹腔注射，200mg/kg，每日1次，连续2天，第3天改用50mg/kg作为维持剂量继续腹腔注射，每日1次，连续3天。诱导时间为5天。2.供体细胞数量对微移植小鼠血象、植入及GVHD的影响实验根据体重随机将雌性CB6F1分为5组，即Ara-C组（化疗对照组）、Ara-C＋1×10~7组、Ara-C＋2×10~7组、Ara-C＋4×10~7组、Ara-C＋8×10~7组。每组10只，所有细胞输注组小鼠于末次化疗后2h内尾静脉输入G-PBSC，对照组尾静脉输入等量的生理盐水。比较不同供体细胞输入数量对小鼠外周血象、植入及GVHD情况影响的差异。3.微移植组与G-CSF组对外周血象影响的比较实验根据体重随机将雌性CB6F1分为3组，即Ara-C组（化疗对照组）、Ara-C＋4×10~7个细胞输注组（微移植组）、Ara-C＋G-CSF组(G-CSF组)，每组10只。对照组尾静脉输入生理盐水，细胞输注组小鼠于末次化疗后2h内尾静脉输入G-PBSC， G-CSF组小鼠给予rhG-CSF10μg/kg皮下注射，每天1次，连续6天。各组小鼠于停化疗第1、3、5、7、9、11、13天采集外周血20μl，EDTA抗凝，利用血细胞分析仪检测小鼠外周血WBC、Hb，PLT数量。4.微移植组与化疗对照组骨髓病理、骨髓细胞集落培养生成单位以及脾脏结构的比较实验：分别于停化疗+5天、+9天各组随机选取3只小鼠进行颈椎脱臼处死，无菌条件下分离出股骨，进行股骨骨髓病理组织形态学改变的观察，并在无菌的条件下留取2×105骨髓细胞进行骨髓细胞集落的培养，观察微移植后小鼠股骨病理组织形态学及形成集落生成单位(CFU)能力的变化。无菌条件下分离小鼠脾脏，行病理组织学检查，观察微移植对小鼠脾脏结构的影响。研究结果：1.化疗后小鼠的血象及骨髓病理变化：化疗后小鼠无呕吐，稀便，停化疗后第1天WBC即明显下降至2.56±0.38，显著低于化疗前10.67±1.64（P<0.01），停化疗第3天WBC降至最低2.32±0.61(P<0.01)，随后逐渐恢复，停化疗13天完全恢复至正常水平。Hb于停化疗后第5天降至最低123.32±4.32(P<0.01),随后开始缓慢回升，停化疗1113天恢复至正常水平。PLT于化疗后快速下降，停化疗第5天降至最低水平455.44±108.42（P<0.01），停化疗第13天基本恢复正常。停化疗第5天的骨髓病理示骨髓腔呈现空虚状态，造血细胞明显减少，为脂肪细胞所代替。实验过程中小鼠无死亡。2.供体细胞输注数量对微移植小鼠外周血的影响：1×10~7组、2×10~7组与对照组相比并无明显的促进WBC恢复的作用，4×10~7组、8×10~7组均能促进WBC较快恢复，但8×10~7组在WBC恢复后会出现下降。将供体细胞数量由1×10~7增加至4×10~7时，微移植促进Hb恢复的作用逐渐增强，但继续增加供体细胞输注数量至8×10~7时，微移植促进Hb的恢复速度并未继续加快。微移植促进PLT恢复的作用随着供体细胞输注量的增加而增强。4×10~7组、8×10~7组在促进PLT恢复方面无显著差异。3.供体细胞输注数量对微移植小鼠植入及GVHD的影响：微移植治疗后1×10~7组、2×10~7组、4×10~7组小鼠在输注H-2半相合供体细胞后获得一过性的供体细胞微嵌合，供体细胞在受鼠体内存在的中位时间分别是6w、8w及10w，并且均未发生GVHD。8×10~7组中80%的小鼠在细胞输注后612w内完全转变为CC，未见明显GVHD体征。4.微移植与G-CSF比较实验中，微移植与G-CSF组对化疗后白细胞的恢复均有促进作用，恢复过程中，两组促进白细胞恢复的速度无显著性差异（P>0.05）。微移植组Hb最低值显著高于G-CSF组与化疗对照组(P<0.01)，+5、+7、+11天微移植组Hb明显高于G-CSF组(P<0.01)。在PLT恢复过程中，微移植组于停化疗+5、+7天PLT高于G-CSF组(P<0.05)，+9、+11天PLT值较G-CSF组差异显著(P<0.01)。5.小鼠骨髓病理组织学变化提示微移植组小鼠造血功能优于对照组小鼠，骨髓集落培养结果亦表明微移植能促进小鼠骨髓细胞形成更多CFU-Mix，小鼠脾脏病理结果提示微移植治疗可能减轻化疗对小鼠脾脏的破坏。研究结论：1.本研究成功建立了H-2半相合小鼠微移植动物模型，为进一步探讨研究微移植促进造血恢复及免疫重建的机制提供了理想的平台；2.微移植对化疗后小鼠的WBC、Hb、PLT恢复方面均有效，在促进WBC恢复的作用方面与公认的G-CSF疗效相当，在促进Hb、PLT恢复方面均好于G-CSF；3.微移植能够促进小鼠骨髓生成更多的CFU-Mix，并可能对脾脏的结构存在保护作用。4.本实验为微移植的临床应用提供了动物实验基础和理论依据。