论文部分内容阅读
番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)感染能够引起番鸭机体的免疫抑制,并破坏番鸭肠道形态结构和黏膜免疫功能,对番鸭养殖业造成严重损失。本课题组前期研究表明猴头菇多糖(Hericium erinaceus polysaccharide,HEP)具有提高机体免疫力、保护和修复肠道黏膜,缓解MDRV所致番鸭免疫抑制的功效。肠道黏膜免疫系统包括诱导部位和效应部位,两者之间主要通过淋巴细胞归巢发生联系,而淋巴细胞归巢是淋巴细胞向炎症效应部位迁移的过程,主要涉及整合素家族、免疫球蛋白超家族的粘附分子和趋化因子等多种细胞因子,它们共同参与淋巴细胞在机体内诱导部位和效应部位之间的迁移,实现淋巴细胞在体内的再循环,进而促进黏膜损伤的修复,因此淋巴细胞归巢机制是阐释HEP对番鸭机体及肠道黏膜产生保护和修复机理的途径之一。本研究首先通过对番鸭十二指肠的转录组高通量测序(RNA-seq),构建基因文库,然后对试验过程产生的基因序列进行注释,为研究番鸭淋巴细胞归巢相关基因的选择提供参考,最后运用ELISA方法对淋巴细胞归巢机制相关因子进行检测,并与转录组结果相互印证,旨在探讨HEP对MDRV感染番鸭的肠道中CCL28/CCR10、CCL25/CCR9、α4β7/MAdCAM-1、CCL21/CCR7、LFA-1/ICAM-1 各因子表达量的影响,为研究HEP调节MDRV感染番鸭机体淋巴细胞归巢的作用机制提供参考,并为HEP预防MDRV感染的临床应用提供理论依据。方法:本研究通过建立MDRV自然感染发病模型,将340只1日龄健康雏番鸭随机分为5组,分别为空白对照组(NCG)、猴头菇多糖对照组(HCG)、同居感染对照组(CICG)、猴头菇多糖预防组(HPG),每组各70只,以及人工感染组(AIG)60只,AIG组于番鸭2日龄人工感染MDRV,5日龄时以2:5的比例分别与CICG和HPG进行同居感染。对试验番鸭在同居感染后第1 d、3d、6 d、10 d、15 d、21 d、28 d和36 d分别进行样本采集,每组各取6只番鸭采集十二指肠,其中第3 d、6 d、21 d的样本采集两份,一份用于转录组高通量测序(RNA-seq)分析,另一份与其他样本一起进行整合素及其配体、趋化因子及其受体的ELISA检测。结果:(1)转录组测序结果显示:①获得约47456230条原始Reads,数据评估结果可靠;获得的80950条组装Unigenes,平均长度1054 bp,N50长度为2523 bp;②注释到Nr、Swissprot、KOG、KEGG数据库中的序列分别有26824、22250、15786、14726条;③得到与近缘物种绿头鸭相似的序列有8113条,占注释到Nr数据库总序列数的30.24%,CDS区比对显示其与绿头鸭同源性较高;④GO注释中有较多的注释基因分别归类到细胞过程、蛋白结合途径,KOG注释中的信号转导机制及KEGG通路主要涉及细胞因子及其受体的相互作用、细胞粘附分子、肠道免疫网络IgA的产生白细胞跨内皮迁移等通路,均与番鸭免疫系统及淋巴细胞归巢有关;CICG组MDRV感染后细胞因子及其受体相互作用通路显著富集,HPG组此通路也存在富集;⑤差异比较中,四组同期相比,同居感染第6 d的上调基因数较多,GO富集差异显示,CICG组MDRV感染后显著(P<0.05)富集于免疫系统进程,细胞因子及趋化因子活动,HPG组显著(P<0.05)富集于免疫系统进程和防御反应,淋巴细胞表面的粘附分子α4β7、LFA-1和趋化因子受体CCR10、CCR9、CCR7在MDRV感染时有显著(P<0.05)上调趋势,而HPG也存在这种上调趋势。(2)ELISA测定结果显示,相较NCG组,MDRV严重感染时,CICG组番鸭十二指肠组织中粘附分子α4β7、LFA-1、趋化因子CCL28、CCL25、CCL21、趋化因子受体CCR9以及CCR7的分泌量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上升;相比CICG组,在感染严重期,HPG组番鸭上述因子分泌量均有不同程度的上调;同居感染第21 d,HPG组LFA-1、MAdCAM-1、CCL28、CCR9,ICAM-1、CCL21 分泌量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于CICG组;同居感染第22 d开始停用HEP,第28 d时,相比第21 d,HPG 组 α4β7、MAdCAM-1、CCL28 分泌量有所下降,CCL25、CCR9、CCR7分泌量有不同程度的上调,而在第36 d时,相比同组第28 d分泌量有所回升,且均极显著(P<0.01)高于CICG组。结论:(1)转录组测序获得80950条基因,与近缘物种绿头鸭相似的序列有8113条,主要涉及细胞因子及其受体的相互作用、细胞粘附分子、肠道免疫网络IgA的产生、白细胞跨内皮迁移等通路,均与番鸭免疫系统及淋巴细胞归巢有关,CICG组MDRV感染后趋化因子及其受体相互作用通路被激活,HEP干预后,细胞活动仍然存在,并刺激了机体的防御反应;(2)MDRV感染后,番鸭机体本身能通过上调小肠组织淋巴细胞归巢受体及相应配体的分泌量,抵抗病毒侵袭,而HEP可以进一步上调感染番鸭小肠组织淋巴细胞归巢粘附分子、趋化因子受体的及其相应配体的分泌量,促进淋巴细胞归巢过程以达到与机体协同抵抗MDRV感染的功效,而且在病毒感染末期停喂HEP一段时间内,HEP对番鸭仍然具有一定的保护作用。