细胞色素P450酶系(Cytochrome P450s)是人体内重要的药物代谢Ⅰ相酶。在一种新药的研发过程中,药物的吸收、分布、代谢及排泄指标对一个候选药物的最终成功非常重要,尤其是代谢物的性质对我们个体的服药安全性有很大的影响。在新药申报时FDA规定当药物被P450酶代谢成多种代谢物同时又是毒性化合物并且对机体内组织或者药物的靶组织产生影响时,必须要测定代谢物的浓度,同时对大于药物总量10%的代谢物要单独做毒性实验。问题是这些代谢物往往是毫克级甚至更少,我们用传统的化学合成途径去合成并且分离时会相当复杂,加上合成过程耗时费力,这样就对代谢物的定性和定量增加了很大的难度。目前药物代谢的研究方式已经逐渐由传统的利用实验动物进行体内实验进入到了体外研究的阶段,这很大程度上得益于分子生物学和基因工程的发展。本课题旨在利用异源表达系统对重组的CYP450s进行高效表达来生产代谢物,建立起体外代谢筛选体系,由体外代谢数据和性质来初步预测体内代谢水平。欧美很多国家在进行新药申报时也会进行这种研究。酵母表达系统由于其高效经济从而被广泛使用。CYP450s参与人体内许多内源性和外源性化合物的化学转化以及绝大都数药物的代谢过程,被称为药酶。其中CYP3A亚家族是整个酶系中极其重要的组成部分,含量约占CYP总量的30%。目前CYP450参与的药物代谢中约有50%是与CYP3A介导有关。CYP3A5曾经一度被认为是缺乏功能意义的假基因。但近年来逐渐成为新的研究热点,目前利用酵母表达CYP3A5生产代谢物的研究还是空白。CYP4503A5亚型是3A家族的一个重要成员,位于人7号染色体,基因全长1726bp, cDNA长度为1509bp。市面上很多药物都是由它进行代谢的。本研究目的是用毕赤酵母在细胞内表达出人CYP4503A5,希望建立起人体外应用酵母生产代谢物标准品的体系。本文主要做了如下工作：(1)将CYP3A5基因同源整合进酵母基因组,使之能够稳定复制传代。CYP3A5基因构建到酵母表达载体上,送去测序。验证正确后转化E.coli DH5α进行大量扩增,然后用SaⅡ限制性内切酶进行线性化处理。乙醇沉淀回收线性化的质粒,将做好的酵母GS115感受态细胞与之混合,在电压1.5kV,电容25μ F,电阻200Ω的条件下进行电击转化。通过电转使得外源基因整合进酵母细胞,然后酵母再通过同源重组把外源基因整合到基因组里；(2)利用MD平板以及PCR方法筛选重组的阳性菌株。电击结束后立即加入冰冷的山梨醇30℃放置1h后涂MD平板。3天后长出转化子,提取阳性转化子的基因组进行PCR验证,野生型菌株得到2.1kb条带(AOX1基因),阳性菌株有两条亮带,分别是2.1kb (AOX1基因)和1.73kb左右(目的基因1509bp+载体同源序列约220bp=1731bp)。通过营养型培养基的初步筛选和PCR的筛选确定了重组子的类型,方便进行下一步的表达研究；(3)利用蛋白电泳和免疫印迹来验证重组菌株的表达情况。先用BMGY培养基培养His+Mut+菌株,离心后用BMMY培养基(含1%甲醇)悬浮沉淀,开始诱导表达。每隔24h添加甲醇至1%浓度并且取样直到诱导96h结束。对每个时间点的样品在低温条件下进行超声破碎处理,浓缩后进行电泳分析SDS-PAGE电泳表示没有特别明显的目的条带出现。Western Blot结果显示在预期位置出现了特异性蛋白条带,但是蛋白表达量不是很高；(4)为了验证酶活性检测代谢物的产生,我们进行底物咪达唑仑和睾酮与微粒体的孵育实验。产生的代谢物证明了毕赤酵母异源表达的CYP4503A5酶具有良好的催化活性,这为大量生产代谢物提供了有用的数据。