研究背景:人脑胶质瘤是成年人中发病率最高、预后不良的原发性脑肿瘤,由世界卫生组织(World Health Organization,WHO)分级的Ⅰ-Ⅳ级不同恶性程度的脑肿瘤组成。弥漫性胶质瘤因其丰富的新生血管和浸润性生长的特性,导致肿瘤复发,严重威胁着人类的生命健康。尤其是恶性程度最高的胶质母细胞瘤,预后极差,患者的平均中位生存期仅为14.8月,5年生存率不到3%。胶质瘤起源于中枢神经系统的胶质细胞,异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase,IDH)突变是驱动胶质瘤发生的早期关键事件。据此,2016年WHO将IDH突变状态、1p/19q共缺失和其它基因(如ATRX缺失、TP53突变)状态引入胶质瘤的诊断归类中,形成了联合组织学和分子学共同特征的“整合诊断”新标准,即将前期以组织学特征命名的星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤对应地分为弥漫性星形细胞瘤(IDH突变型、IDH野生型和NOS型)、少突胶质细胞瘤(IDH突变和1p/19q共缺失和NOS型)少突星形细胞瘤,NOS型和胶质母细胞瘤(IDH突变型、IDH野生型和NOS型)。其中弥漫性星形细胞瘤由WHO Ⅱ级弥漫性星形细胞瘤,IDH突变型和WHO Ⅲ级间变性星形细胞瘤,IDH突变型组成;少突胶质瘤可由WHO Ⅱ级的少突胶质细胞瘤,IDH突变和1p/19q共缺失以及WHO Ⅲ级的间变性少突胶质细胞瘤,IDH突变和1p/19q共缺失组成;而胶质母细胞瘤皆为恶性程度最高的WHO Ⅳ级组成,分为胶质母细胞瘤,IDH突变型,胶质母细胞瘤IDH野生型以及儿童的弥漫性中线胶质瘤,H3K27M突变型。不同胶质瘤类型在基因突变、恶性分级、临床表现、生长方式以及对治疗的敏感性、反应性和临床结局等方面存在高度异质性和复杂性,由此导致胶质瘤的治疗效果仍不理想的结局。而研究和开发出有效的肿瘤特异性治疗方法或药物是目前解决这一困境的热点和焦点课题。建立可靠的能够模拟患者生物学特性的临床前动物模型是实现胶质瘤个体化治疗和药物筛选与评价的关键途径。基于传统的来源于胶质瘤细胞系如U87、U251、T98G的移植瘤,由于这些细胞经过长期的体外培养,其生物学特性与人胶质瘤有巨大差异,不能代表人胶质瘤的生物学特征。胶质瘤患者源性异种移植瘤(Patient-derived Xenografts,PDXs)在肿瘤形态和分子生物学等特征方面与人脑胶质瘤特性最为接近,被公认为目前最可靠的胶质瘤临床前研究模型。有关胶质瘤的PDXs研究主要集中于脑原位的PDXs和皮下PDXs两大类。将患者胶质瘤组织消化经过短期培养获得肿瘤细胞或干样肿瘤细胞移植至动物脑原位建立的患者源性原位异种移植(Patient-derived Orthotopic Xenograft,PDOX)模型与患者原发肿瘤在组织形态、生长方式以及分子遗传等方面有很大程度的相似性,且简便可行。但由于移植细胞为肿瘤实质细胞,缺少肿瘤细胞赖以生存和演进的基质细胞如成纤维细胞、免疫细胞或血管内皮细胞等,故而缺乏影响肿瘤生长的微环境。新鲜组织块的PDOX模型实施难度较大,早期有两个研究团队先后报道通过组织块法成功建立了胶质母细胞瘤PDOXs,但最近韩国学者报道应用组织块法未能成功建立PDOX模型。除PDOX模型外,将胶质瘤患者来源的组织块移植于免疫缺陷小鼠皮下建立的胶质瘤异位PDXs因具有操作简单、方便,移植瘤易于观察和传代等优点而广泛应用于生物样本库的建立、新药筛选与测试、患者预后的生物标记预测以及患者个性化治疗研究。目前通过组织块法建立的胶质瘤异位PDX模型主要集中于人胶质母细胞瘤,这些研究报道移植瘤仅在皮下呈局限性生长,从未观察到皮下移植瘤的侵袭和复发。同时包括WHO Ⅱ—Ⅳ级在内的多种级别联合胶质瘤PDXs模型的建立及其生物学特性的研究并未见报道。基于以上研究背景,我们的研究围绕以下两个部分展开:1.在获得患者知情同意后,收集WHO Ⅱ—Ⅳ级胶质瘤患者术中手术切除的肿瘤组织,经皮下移植到NOD-Prkdcscid 112rgnull(NPG)小鼠建立PDX模型,通过大体观察移植瘤存活情况,统计分析成瘤与患者临床参数的相关性,确定成瘤与胶质瘤患者年龄、性别以及胶质瘤级别、IDH突变状态和核增殖指数Ki67表达的相关性;待移植瘤生长至合适大小,进行传代至1-6代,应用游标卡尺测量移植瘤生长,评价各代次移植瘤生长潜伏期和生长速度;手术切除肉眼所见的全部移植瘤,观察切除后的移植位置是否再次生长出移植瘤,评价移植瘤保持患者胶质瘤的复发特性;通过观察除移植位置之外的移植瘤生长情况,评价移植瘤保持患者胶质瘤的侵袭性生长或扩散生长的特性。通过上述研究,以期评价患者胶质瘤来源的异种移植瘤模型成功建立的相关因素及其生长特性。2.取不同代次的移植瘤和患者胶质瘤,通过苏木素伊红(H&E)染色、免疫组织化学染色评价不同代次移植瘤是否保持了患者胶质瘤的组织学和免疫学特征;通过荧光定量q-PCR评价不同代次移植瘤是否保持了患者胶质瘤的携带IDH基因状态;最后应用短串联重复序列(Short Tandem Repeat,STR)技术鉴定了移植瘤与患者胶质瘤在微卫星稳定性方面的一致性。通过上述研究,我们成功建立起WHO Ⅱ—Ⅳ级人脑胶质瘤患者源性NPG小鼠皮下PDX模型,移植瘤成功率有赖于胶质瘤的IDH野生状态和核增殖指数Ki67的高表达状态,移植瘤保持患者胶质瘤弥漫侵袭性生长特性,形态组织学特征以及分子遗传学特征,为胶质瘤发病机制、新药发现与筛选以及患者个体化治疗等研究提供理想的疾病模型。第一部分:不同级别人脑胶质瘤患者源性NPG小鼠异种皮下移植瘤模型的建立及其生长特性方法在取得患者知情同意书后,收集在重庆医科大学附属第一医院脑外科就诊的WHO Ⅱ—Ⅳ级胶质瘤患者手术标本和临床数据,将胶质瘤剪成3-5mm大小后,经皮下移植到NPG小鼠背部两侧,通过观察移植瘤存活、生长速度、生长方式,分析移植瘤存活与胶质瘤患者性别、年龄和胶质瘤级别、大小、IDH突变状态以及核增殖抗原Ki67的相关性。待移植瘤长至直径约为1.5cm或两处肿瘤生长接触时,取部分移植瘤再次经皮下移植到新的NPG小鼠进行肿瘤传代。成瘤后,每周测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,评价不同代次移植瘤生长潜伏期、生长特点。手术切除肉眼所见的全部移植瘤,观察切除后的移植位置是否再次生长出移植瘤,评价移植瘤保持患者胶质瘤的复发特性;通过观察除移植位置之外的移植瘤生长情况,评价移植瘤保持患者胶质瘤的侵袭性生长或扩散生长的特性。通过上述研究,以期确定出建立人源性胶质瘤异种移植瘤的成瘤率与患者临床参数的相关性、移植瘤保持患者胶质瘤的生长特性。结果在收集的28例手术胶质瘤标本中,16例进行了有效移植,因标本污染或移植后1个月小鼠内死亡而排除12例。在有效移植的16例中,WHO Ⅱ级胶质瘤3例,Ⅲ级5例以及Ⅳ级8例。对胶质瘤患者临床参数与移植瘤成功的相关性进行统计分析,发现胶质瘤移植成功与高于5%的Ki67表达(11/13 vs.0/3,P=0.004)和IDH1野生型呈正相关((9/9 vs.2/7,P=0.002),而与患者年龄、性别、胶质瘤大小无关。总体移植成功率为68.75%(11/16),其中Ⅱ级移植成功率为33.3%(1/3),Ⅲ级移植成功率为60%(3/5),Ⅳ级移植成功率为87.5%(7/8)。随着胶质瘤的级别增加,移植成功率呈增加的趋势,但并无统计学差异。对移植瘤生长曲线分析,发现患者胶质瘤移植小鼠后经过一个潜伏期,其中P1代Ⅱ级潜伏期为11周,Ⅲ级潜伏期在14～22周之间,Ⅳ级则为5～22周,后进入快速生长期,低级别胶质瘤的潜伏期相较于高级别胶质瘤更长;第2代及其以后代次则潜伏期较短或无潜伏期。有趣的是,Ⅲ级间变性少突胶质瘤IDHMUT在移植处位置之外扩散性新生了移植瘤。同时,我们还观察到Ⅱ级弥漫性星形细胞胶质瘤IDHWT移植瘤第二代(P2)和Ⅳ级胶质母细胞瘤IDHWT复发肿瘤在移植瘤第三代(P3)切除移植瘤后肿瘤复发。结论通过人胶质瘤患者的新鲜组织块移植法建立起人源性WHO Ⅱ—Ⅳ级胶质瘤NPG小鼠皮下PDX模型,胶质瘤成功移植与表达率高于5%的Ki67和IDH1野生状态相关,成功率在33.3-87.5%之间;移植瘤在P1代经过5～22周的潜伏期后进入快速生长期,第2代及其以后代次潜伏期较短或无潜伏期;另外,移植瘤还保持了患者胶质瘤向远处扩散的侵袭性和手术切除后复发性生长的特性。第二部分:人源性胶质瘤PDX模型的鉴定及其生物学特征方法待移植瘤生长至直径约为1.5cm大小时,取部分移植瘤进行下述三方面研究:1.移植瘤传代:当移植瘤生长至合适大小时,无菌手术操作取移植瘤经皮下移植到新的NPG小鼠背部一侧或两侧,进行肿瘤传代,最多传至6代;2.另取部分移植瘤进行液氮冷冻保存,以备移植瘤复苏或其它用途;3.比较各代次移植瘤在组织形态学、免疫表型、新生血管、增殖能力以及遗传学等方面与对应患者的胶质瘤特性代表性,具体进行下述3方面内容研究:(1)取各代次移植瘤和患者胶质瘤组织块,经10%中性缓冲福尔马林固定后,行脱水、透明、包埋、切片以及H&E染色,光学显微镜观察各代次移植瘤和患者胶质瘤的组织形态、结构以及组成成分的特征和变化,评价移植瘤与对应患者胶质瘤在组织形态以及病理改变是否具有相似的特征;(2)取上述移植瘤和患者胶质瘤石蜡切片或冰冻切片,应用免疫组织化学研究胶质瘤特异性表达分子胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)、少突胶质细胞特异转录因子(Oligodendrocyte Lineage Transcription Factor2,Olig-2)和波形蛋白(Vimentin)的表达水平,评价移植瘤在瘤细胞分化程度方面与患者胶质瘤的异同;应用抗人和抗小鼠血管内皮表达分子CD31单克隆抗体进行免疫荧光双标染色,评价各代次移植瘤在多大程度上保持了患者肿瘤的血管;应用核增殖标记分子Ki67免疫组织化学染色法,对照研究移植瘤和患者胶质瘤增殖能力的异同。通过这些研究,以期评价各代次移植瘤与患者胶质瘤在免疫表型、血管新生以及增殖能力方面的一致性;(3)提取各代次移植瘤和对应患者胶质瘤DNA,应用实时荧光定量Q-PCR法研究各代次移植瘤在胶质瘤分子分型基因IDH携带状态方面是否保持了对应患者胶质瘤的一致性;利用STR技术研究各代次移植瘤和患者胶质瘤在遗传微卫星多态的稳定性;通过上述研究,以期评价移植瘤维持对应患者胶质瘤遗传学特征的稳定性。结果H&E染色结果显示,WHO Ⅱ—Ⅳ级患者源性的移植瘤保持了各自级别胶质瘤在组织病理形态学方面的异质性和多样性;同一级别的各代次移植瘤总体保持了对应患者胶质瘤的组织结构和形态特征,但在细胞密度、异型性以及血管内皮细胞增殖方面,移植瘤较患者胶质瘤增强。GFAP、Vimentin和Olig-2免疫染色结果显示,移植瘤维持了患者胶质瘤的关键免疫表型,但其GFAP表达下降和波形蛋白表达增加。免疫荧光双标人和小鼠CD31表达结果显示,与对应患者胶瘤相比,PDX肿瘤组织鼠源性血管内皮细胞CD31表达增加,而人源性血管内皮细胞CD31表达减少。Ki67结果表明,PDX肿瘤细胞的增殖能力明显强于患者胶质瘤。IDH基因表明,大部分PDX肿瘤保持了患者胶质瘤IDH基因携带情况,仅一例IDH1野生型的胶质母细胞瘤在P1代发生了 R132H突变,但在随后的传代中又发生回复突变成IDH1野生型。STR结果显示,不同患者来源的不同级别的胶质瘤个体间保持了个体独特的异质性,而大多数各代次的移植瘤严格保存了患者来源的胶质瘤微卫星DNA特征,仅两例标本出现了基因片段的丢失。结论利用NPG小鼠建立起的源于人WHO Ⅱ—Ⅳ级脑胶质瘤移植瘤在生长方式、组织形态学、免疫表型和基因学特征上都与对应患者肿瘤保持高度一致性,可为胶质瘤发病机制、临床前新药筛选与评价以及患者个性化治疗提供有效策略。