目的癌症免疫治疗的主要目的是诱导有效的抗肿瘤特异细胞毒T淋巴细胞(CTL)，而主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类分子在一系列恶性肿瘤中往往低表达，不足以在体内引起有效的免疫应答。人癌症中的自身抗原是免疫系统识别的最普遍抗原，说明癌细胞源于宿主自身组织而非外源蛋白。识别自身抗原存在许多问题，如由于自身耐受难以引出抗肿瘤免疫。即使免疫系统能识别并与自身抗原反应，通常免疫力也不足以排斥肿瘤。FasL是肿瘤坏死因子(TNF)蛋白家族的一个成员，组织学和流式细胞仪分析提示FasL表达细胞能引起局部中性粒细胞浸润，产生强烈的炎症，使肿瘤细胞受损，之后依赖CD8~+T淋巴细胞的抗肿瘤免疫，导致肿瘤细胞的清除。B16F10恶性黑色素瘤免疫原性极弱，因此是研究提高肿瘤免疫策略的良好模式。恶性黑色素瘤最具特色的抗原是非突变分化抗原，不仅表达于恶性黑色素瘤细胞，也表达于正常黑色素细胞，如糖蛋白100(gp100)，酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白(TRP)1和2、黑素A(Melan-A)。从这些抗原中选择3个有肿瘤排斥功能的抗原决定簇：TRP2、鼠糖蛋白100(mgp100)和它更具免疫源性的对应物人gp100(hgp100)。此外，还选择了2个在B16F10中表达的内生性病毒抗原决定簇恶性黑色素瘤抗原肽(mdm)、逆病毒包膜蛋白(p15E)，合成抗原肽，制作Tetramer。MHC-Ⅰ类分子-肽四聚体复合物技术是近年牛津大学同美国STAN-FORD大学共同研制发明的。它可以通过荧光激活细胞分类仪(FACS)在单细胞水平直接检测抗原特异性CTL，并同时进行细胞定量。经放射并表达FasL的B16F10细胞皮下注射使鼠产生免疫，3周后野生型B16F10激发，保护鼠行tetramer分析。牛痘病毒不仅诱导体液免疫，且强烈地诱导细胞免疫。因此，为了提高免疫应答，部分保护鼠用含黑色素分化抗原的重组牛痘病毒(rVV)加强。体内抗原特异杀伤还用另一种新技术来检测。希望我们的观察能帮助确定新的肿瘤细胞表面标志物，提供一种刺激产生广谱抗肿瘤免疫的新途径。实验方法本实验用B16F10恶性黑色素瘤C57BL／6鼠模型。使用2种技术来检测免疫鼠中抗原特异CTL活性。1) MHCⅠ类分子-肽-tetramer。选择5种相关肿瘤抗原决定簇，合成抗原肽，其氨基酸序列如下：mdm(Kb)：YAMIYRNL，p15E(Kb)：KSPWFTTL，trp-2(v)(K~b)：VYDFFVWL，trp-2(s)(K~b)：SVYDFFVWL hgp100(D~b)：KVPKNQDWL，mgp100(D~b)：EGSRNQDWL，制作相应tetramer：BirA生物素酶识别位点的MHC-H-2K~b或H-2D~b的胞外区、β2m的cDNA被克隆进入表达质粒，蛋白以包涵体形式在大肠杆菌(E.coli)中表达。重链、β2m和合成抗原肽在4℃含蛋白酶抑制剂的缓冲液中折叠，形成稳定的三分子复合物。浓缩后，复合物酶标生物素酰基化，由快速蛋白液相色谱(FPLC)按照分子量大小纯化。生物素酰基化蛋白单体与结合荧光素的细菌蛋白以4∶1摩尔比率混合。2)体内杀伤分析。CFSE是一种分子探针染料，在488nm可激发绿色荧光，因此可通过流式细胞仪检测。树突状细胞(DC)如与荧光染料结合，可在引流淋巴结中被检出。DC与MHC-Ⅰ类分子抗原肽结合，可作为CTL的靶，如存在抗原特异CTL，结合抗原DC的特异杀伤就能在不同小鼠中被检测出来。结合CFSE的同源靶细胞(脾)加入相关抗原肽，尾静脉注入保护鼠，5～18小时采集鼠血或鼠脾，FACS分析。标记相关抗原肽的靶细胞由于被特异CTLs识别和杀伤，应该减少或消失。将实验与对照鼠分成4组，施以不同处理因素：FasL，rVV(mgp100，NP)，FasL+rVV组，对照组，用以初次免疫激活。用自然鼠脾细胞与抗原肽(hgp100，Np)加强一次，行tetramer检测及体内杀伤实验。体外培养各组脾细胞建立CTL细胞系，共分两组，1组用hgp100刺激，末次刺激后一周用hgp100，mgp100两种tetramer检测，另1组分别用6种抗原肽刺激，末次刺激后行tetramer交叉检测。实验结果我们建立起一种tetramer与碘化丙啶(PI)相结合的技术。排除PI阳性细胞，有助于减少死细胞非特异染色，提高染色质量。重复多次实验，除一只rVVNP处理鼠作为阳性对照，脾脏中检出抗原特异CTL，其他各组血液、淋巴结、脾tetramer检测均阴性。我们共进行了5次杀伤实验，均难以解释。由于没能从鼠中得到足够细胞，标记CFSE、结合抗原肽的对照峰和相关峰都较低。血液标本出现双峰，脾脏检测出现单峰。与其他组相比，FasL+rVVgp100组，峰高明显降低，但无抗原特异性，因为对照峰与相关峰均降低。体外细胞培养，第1组中rVV处理细胞、FasL+rVVgp100处理细胞，tetramer检测，出现抗原特异CTL，hgp100、mgp100 tetramer检测均阳性，其它组阴性。第2组中FasL+rVVgp100处理细胞，出现tetramer交叉检测阳性，其它处理因素脾细胞检测阴性，提示在一些标本中存在非特异背景染色。结论1．tetramer技术能精确检测肿瘤抗原特异CTL。2．FasL与rVVgp100两种处理因素联合能打破恶性黑色素瘤B16F10的自身耐受状态，产生抗原特异性CTL。3．FasL与rVVgp100两种处理因素联合，可能诱导固有免疫，产生非特异性杀伤。4．FasL与rVVgp100两种处理因素联合，能扩大免疫效应，产生抗原交叉反应。5．小鼠免疫成功与否，与不同小鼠不同免疫状态及反应性有关。将来有必要扩大每组小鼠数量。6．FACS检测体外培养细胞时，同时使用PI能去除死细胞干扰，提高染色质量。7．细胞体外培养，末次刺激后两周tetramer检测达高峰。8．本研究结果为研制肿瘤疫苗、制定肿瘤治疗策略提供了新思路。