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多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是一种育龄期妇女常见的内分泌功能紊乱性疾病,主要临床症状为稀发排卵或无排卵,高雄激素血症,卵巢“多囊样”影像学体征及胰岛素抵抗等代谢体征,具有较大的个体差异性。在PCOS疾病生理学中,下丘脑-垂体-卵巢轴(Hypothalamus-pituitary-ovary axis,HPO轴)功能失调,导致卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)及黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)分泌失调诱发排卵障碍的发生机制仍未明确。近年来,针对PCOS发生机制的研究主要集中于HPO轴对排卵功能的调控,已有大量研究证实了PCOS患者的促性腺激素释放激素GnRH(Gonadotropin Releasing Hormone,GnRH)/LH分泌紊乱,促进卵巢分泌过多雄激素,雄激素对下丘脑的负反馈作用又会干扰FSH的分泌,造成卵泡发育障碍。GnRH神经元在哺乳动物下丘脑中分布弥散,其上游受Kisspeptin神经元及KNDy(Kisspeptin/Neurokinin/Dynorphin)神经元调控。已有研究证实,正常的GnRH脉冲式分泌频率是规律生殖周期的基础,在PCOS发病机理中,卵巢局部的激素分泌紊乱(如雄激素分泌过多)反馈到下丘脑,导致GnRH分泌紊乱及HPO轴调控排卵功能障碍。此外,雄激素过高也会导致胰岛素抵抗,肥胖等代谢症状,加剧PCOS患者的内分泌紊乱。由于中枢神经内分泌机制较为复杂,其在PCOS发病机理中的具体作用尚未有明确的论述,目前对PCOS的临床治疗主要是对症治疗(如降低雄激素,促排卵助孕等)而非对因治疗。因此,阐明雄激素对下丘脑GnRH释放以及HPO轴的作用对PCOS的发病机制解释及临床诊断、治疗均有非常重要的意义。本研究通过皮下埋植双氢睾酮(5α-dihydrotestosterone,DHT)构建PCOS大鼠模型,探讨高雄激素对大鼠下丘脑神经内分泌机制的影响以及导致大鼠排卵障碍的神经内分泌学机制;同时,我们利用小鼠下丘脑瘤细胞系GT1-7细胞研究高雄激素在体外实验中对神经元细胞信号通路的影响,阐述雄激素对神经细胞的作用机制。此外,根据体外实验的结果,我们在大鼠体内做了体内验证实验,为PCOS的病因学临床治疗提供了可靠的科学基础。第一部分高雄激素诱导雌性大鼠排卵障碍的中枢神经内分泌学变化目的:构建排卵障碍大鼠模型,观察导致大鼠排卵障碍的神经内分泌学改变,并在体外实验中上验证其对神经细胞的分泌功能的影响。方法青春前期(3周龄)雌性大鼠颈背皮肤下埋植含有7.5mg双氢睾酮(DHT)药物粉末的硅胶管,观察青春期(4周龄),青春后期(6周龄)及成年期(12周龄)大鼠体重,卵巢切片,动情周期及外周血激素分泌频率,并比较DHT组及对照组大鼠的下丘脑神经内分泌因子表达水平。此外,为了验证是否GnRH分泌与DHT及内质网应激的关系,应用小鼠下丘脑瘤细胞系GT1-7细胞,观察DHT及内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)诱导剂-毒胡萝卜素TG(Thapsigargin)对细胞分泌GnRH的作用。结果DHT组大鼠自青春期起体重增长明显快于对照组(p<0.01);观察其卵巢染色切片发现,DHT组大鼠囊状卵泡及闭锁卵泡数明显增多,成熟卵泡及黄体减少。与对照组比较,青春后期的DHT大鼠阴道涂片观察发现缺少规律的动情周期,并且外周血LH分泌频率明显紊乱。青春期、青春后期及成年期DHT组大鼠下丘脑核团内质网应激通路因子较对照组表达明显上调(p<0.05),且Kisspeptin表达明显下调(p<0.05),证实DHT诱导了大鼠排卵紊乱及下丘脑ER stress水平增加,Kisspeptin表达被抑制。此外,DHT及TG处理均能显著地抑制GT1-7细胞分泌GnRH,Kp可以明显增加GnRH分泌(p<0.05),证实DHT及内质网应激都能干扰神经细胞分泌GnRH,Kp可以抑制DHT及内质网应激的作用。第二部分高雄激素诱发排卵障碍大鼠的中枢神经内分泌学紊乱以及GT1-7细胞的GnRH分泌紊乱的机制研究目的:在体外试验中研究造成神经细胞分泌功能障碍的机制,并在体内实验中验证对模型大鼠神经内分泌功能的影响。方法使用100nmol/L浓度的DHT,DHT+Kisspeptin/毒胡萝卜素TG(Thapsigargin),TG+Kp分别处理GT1-7细胞30分钟及24小时,收集细胞RNA、蛋白及培养液,检测内质网应激通路因子表达及细胞分泌的GnRH的浓度。此外,我们使用siRNA转染细胞的方法使内质网膜蛋白PDI(Protein disulfide isomerase)下调,特异性激活内质网应激信号通路,观察细胞Kp表达及GnRH分泌;单细胞荧光显微技术用于检测细胞内第二信使——钙离子的变化。为了验证体外试验的结果,我们首先运用侧脑室注射的方法向DHT组大鼠侧脑室内注射Kp以及内质网应激抑制剂Salubrinal,1小时后观察大鼠下丘脑的内质网应激水平的变化及LH分泌。结果使用DHT处理后发现细胞内质网应激通路因子RNA及蛋白水平表达均显著增加(p<0.05);而同时加入Kp(即DHT+Kp)其内质网应激水平与DHT组比较显著下降(p<0.05或0.01)。应用内质网应激诱导剂TG及TG+Kp处理细胞后,发现Kp仍能抑制内质网应激作用,并且可以恢复细胞分泌GnRH的能力。单细胞荧光测钙试验中,单用TG可明显促进细胞的钙电流,但用Kp预处理后,TG的作用被明显抑制(p<0.05)。此外,为了验证体外试验的结果,应用侧脑室注射的方法向DHT组大鼠侧脑室内注射的Kp,发现DHT组大鼠下丘脑中内质网应激水平被显著抑制(p<0.05);同时向DHT大鼠侧脑室注射Salubrinal,下丘脑局部内质网应激水平以及LH过度分泌被显著抑制(p<0.05)。结论1、本研究通过对雌性大鼠皮下埋植双氢睾酮缓释硅胶管,成功构建了排卵障碍大鼠模型。该模型表型与人类PCOS症状相似,包括超重、肥胖、外周高雄激素以及排卵障碍,该模型为进一步探索人类PCOS病理生理学机制奠定了基础。2、本研究通过排卵障碍模型大鼠神经内分泌系统的验证,创新性地对大鼠模型的排卵障碍神经内分泌学机制进行系统的分析。研究结果显示,外周雄激素作用可导致模型大鼠中枢下丘脑GnRH分泌紊乱,下丘脑局部内质网应激通路表达水平显著增加,Kp/GPR54通路表达被抑制,可能是导致其排卵障碍的神经内分泌系统主要原因,为PCOS病理生理学机制提供实验基础。3、本研究中,体外试验结果证实,DHT可以明显上调下丘脑神经细胞的内质网应激表达水平,同时显著抑制下丘脑神经细胞GnRH分泌功能;而Kisspeptin可以明显抑制DHT或其他药物诱导的内质网应激作用,同时可以使下丘脑神经细胞分泌GnRH功能恢复。4、本研究中,一系列体外实验证实,DHT可能是通过下丘脑神经细胞内质网膜上的PDI因子介导,上调细胞内质网应激水平;而Kisspeptin可能是通过下丘脑神经细胞胞质中第二信使钙离子的作用,抑制细胞内质网应激水平的。阐明雄激素及Kisspeptin对下丘脑神经细胞的潜在作用机制,为研究人类神经内分泌系统-中枢神经调节提供实验基础及思路。5、在本研究中,通过对排卵障碍模型大鼠侧脑室注射相关药物,观察下丘脑局部环境改变对大鼠神经内分泌功能的影响。研究结果发现,外源性注射Kisspeptin或药物可成功抑制排卵障碍模型大鼠下丘脑局部内质网应激水平,并且影响大鼠下丘脑/垂体分泌GnRH/LH,证实排卵障碍中的神经内分泌改变可以通过改变下丘脑局部环境而实现,同时,在体内实验中进一步验证了体外实验的结果。6、上述研究结果证实,青春期前暴露于雄激素可以导致中枢神经内分泌系统功能改变,导致排卵障碍。本研究初步探索了PCOS最代表性症状——排卵障碍的神经内分泌学病理生理机制,创新性地提出内质网应激以及Kisspeptin可在其发病机制中起重要作用,为阐明PCOS发病原因提供理论及实验基础,为预防、诊断及治疗PCOS提供理论依据。