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马尔尼菲蓝状菌病（Talaromycosis marneffei,TSM）是由马尔尼菲篮状菌（Talaromycesmarneffei,TM）感染所致的机会性、播散性真菌病,在我国南方的广西、广东,以及东盟国家呈区域性流行。以往认为该病主要发生在AIDS患者以及羅患肿瘤、自身免疫性疾病和使用免疫抑制剂的继发性免疫功能低下者。但值得注意的是,近年来所发现的非HIV播散性TSM成人与儿童患者数量逐年上升,且极少存在上述发病基础,这提示我们非HIV的TSM患者还存在其他免疫缺陷。近年来,遗传多态性与真菌病易感性的关联以及基因缺陷导致的天然免疫受损在真菌病发病机制中的作用日益受到国内外学者的关注。因此,本论文从遗传易感性的角度,对非HIV的成人与儿童TSM患者的免疫学发病机制进行研究。第一部分遗传易感性与非HIV成人马尔尼菲篮状菌病的相关性及机制目的:前期研究发现非HIV成人感染TM与抗IFN-γ自身抗体相关,但是抗IFN-γ自身抗体在TSM致病机制中的作用尚未阐明,并且非HIV成人TSM患者中是否还存在遗传性免疫缺陷值得深入探究。本研究的目的:1.从免疫和遗传的角度,首先寻找非HIV成人TM感染者的易感基因,并根据筛检结果进一步筛查感染相关细胞因子自身抗体。2.若排除上述致病因素,则进一步探讨抗IFN-γ自身抗体对THP-1细胞STAT1磷酸化的影响,并观察IFN-γ自身体对单核巨噬细胞极化和吞噬、杀伤TM的影响。方法:1.以间接ELISA检测55例非HIV成人TM感染者的抗IFN-γ自身抗体。2.用Luminex技术对55例非HIV成人TM感染者的真菌感染免疫相关的细胞因子（IL-3、IL-8、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-33、TNF-a、TGF-β、GM-CSF、IL-17A、M-CSF、G-CSF、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-5）自身抗体进行检测。并采用ELISA法对抗体阳性患者血浆进行二次验证。2.采用全外显子测序法对55例患者的外显子进行分析,并对突变的单基因和真菌感染免疫通路富集进行注释和统计。4.以流式细胞技术检测抗IFN-γ自身抗体对THP-1细胞STAT1磷酸化表达的影响,及抗IFN-γ自身抗体对THP-1单核巨噬样细胞极化的影响。以细胞培养和CFU等方法评估抗IFN-γ自身抗体对THP-1单核巨噬样细胞吞噬和杀伤TM的影响。结果:1.55例非HIV成人TM感染者中,52例（94.5%）患者外周血中抗IFN-γ自身抗体为阳性,3例（5.4%）患者抗体为阴性。2.通过全外显子检测,未发现55例患者有相关通路富集,且未发现真菌相关通路的单基因变异。3.抗IFN-γ自身抗体显著影响了 IFN-γ对THP-1细胞的STAT1磷酸化,并影响了 THP-1单核巨噬样细胞向M1分化。抗IFN-γ自身抗体影响了THP-1单核巨噬样细胞的杀伤功能,但对吞噬功能无显著影响。4.我们发现1例患者存在抗IFN-γ自身抗体阳性的同时,还携带抗GM-CSF自身抗体,此抗体具有显著中和活性。结论:1.以抗IFN-γ自身抗体为主的细胞因子自身抗体是非HIV成人感染TM的主要致病机制,但不能排除抗GM-CSF自身抗体的影响,必要时应进行多种抗细胞因子自身抗体的筛查。2.抗IFN-γ自身抗体可通过降低巨噬细胞杀伤能力导致TM易感,是非HIV成人感染TM的主要致病原因。3.单基因缺陷导致的原发性免疫缺陷不是非HIV成人TSM患者发病的相关因素。第二部分 遗传易感性与非HIV儿童马尔尼菲篮状菌病的相关性及机制目的:从遗传易感的角度,深入探讨非HIV儿童感染TM的发病机制。同时,总结患儿的流行病学特点、临床特点和抗真菌治疗经验,为临床诊治提供更多的理论依据。方法:1.对13例HIV阴性TM感染患儿的流行病学和临床特征数据进行统计和总结。2.利用Luminex技术对其中13例患儿血浆中的19种真菌感染免疫相关的细胞因子（IL-3、IL-8、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-33、IFN-γ、TNF-a、TGF-β、GM-CSF、IL-17A、M-CSF、G-CSF、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1 β、IL-5）自身抗体进行检测。3.经知情同意后,对10例患者（P1-P10）进行了外周血采样,并采用全基因组外显子测序并筛选出致病基因。4.在可获得样本的条件下,抽取7名患者（P1-P9,P9）的PBMC并与灭活的TM孢子共培养,用实时荧光定量（quantitative real-time PCR,qPCR）技术,检测患者PBMC中易感基因RNA的表达水平。5.Meso Scale Discovery（MSD）技术检测细胞上清液中10种细胞因子（GM-CSF,IFN-γ,IL-12p70I,TNF-α,IL-17A,L-1β,IL-10,IL-2,IL-4,IL-6）的表达水平。6.通过医院HIS系统和电话追踪对其中11例（P1,P3-P8,P10-P13）患儿的抗真菌治疗的疗效和安全性,并做回顾性研究和评估。结果:1.病历资料:（1）13例非HIV的TM感染患儿的男女比例为10:3;（2）发病多集中在春秋两季,平均发病年龄为19（3.5-84）个月。（3）11例患者曾被误诊为肺炎或肺结核,误诊率84.6%。（4）7名患儿死亡,死亡率为53.8%。2.在13例患者的血浆中未检测出以上19种细胞因子自身抗体,但T细胞及免疫球蛋白均存在异常。3.外显子结果显示:（1）10例患者均合并原发性免疫缺陷,其中共包括有8个基因的13个位点突变被检出:P1、P2:STAT1突变,P3、P4:CD40L 突变,P5:STAT3 突变,P6:CARD9 突变,P7:IL-2RG1 突变,P8:LYST 突变,P9:IL-7R 突变和 P10:KRAS 突变。（2）其中 CARD9,IL-7R,LYST,IL2RG,KRAS基因均首次发现与TM感染相关。（3）这12个突变位点中,8 个为新发现位点（CD40LG:c.634635del,c.619620del;STAT3:c.1674C＞T,c.1673G＞T;CARD9:c.1144C＞T,c.658G＞C;IL7R:c.355dupA;LYST:c.8368A＞C;IL2RG:c.217A＞C）,4 个位点已有文献报道（STAT1:c.821G＞A,c.1175T＞C;LYST:c.281C＞T;KRAS:c.35G＞C）。4.qPCR 结果显示:STAT1（P1、P2）,CD40L（P3、P4）,STAT3（P5）和CARD9（P6）的RNA表达水平较对照组下降,IL2GR1（P10）基因RNA的表达水平较对照组上调。MSD结果显示PBMC对TM刺激后的细胞因子表达量呈不同程度的减弱。5.抗真菌治疗评估显示:在11例接受长期抗真菌治疗并随访的患儿中,10名儿童接受了伏立康唑治疗,大部分儿童（7/10）在初次和长期随访中被评估为完全有效。3名患儿死于TM感染。1名患儿在治愈TM感染后无复发,但一年后死于白血病。1名患儿接受了伊曲康唑治疗,患儿目前病情好转且无复发。在治疗期间和之后均未记录到与抗真菌治疗有关的不良事件。结论:原发性免疫缺陷（Primary immunodeficiencies,PIDs）是非 HIV儿童感染TM的主要原因,一旦发现非HIV患儿感染TM应及早进行WES检测分析查找PIDs。伏立康唑抗TM感染有效且安全,可用于TM播散性感染的非HIV儿童的治疗。