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肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic ischemia reperfusion injury，HIR)是指肝脏缺血后重获血流灌注或氧供后，肝脏损伤会在缺血缺氧损伤的基础上进一步加重。肝缺血再灌注损伤的同时，可引起明显内毒素易位，恢复有效组织灌流后，内毒素易位持续存在。其中肝脏是内毒素最早、最主要的分布场所。内毒素可在肝脏组织中长时间地保存其生物活性。肝移植是治疗终末期肝病的最重要的进展，供肝来源匮乏与等待供肝人数的矛盾日显突出。在美国及西欧等一些国家，供肝除少数来自亲属外，绝大部分来自脑死亡供体，供肝不存在热缺血问题。然而在我国，所采用的供肝几乎均来自无心跳供者(NHBD)，供肝不可避免地经历一段热缺血再灌注损伤，且在冷保存及肝复流过程中会进一步遭受损伤。除经济及技术等因素外，供肝质量不好被认为是制约我国肝移植长期疗效的重要因素。目前尽管取肝技术及供肝保存技术已较成熟，但HIR损伤仍为引起肝移植术后肝功能不全及并发症的重要因素之一。 NF-κB是一种广泛存在的快反应转录因子，可上调炎症因子的基因转录而引发炎症瀑布反应，诱导肝损伤。I-κB激酶(IKK)-β是NF-κB活化的关键上游激酶，也是众多NF-κB活化的上游信号转导通路的最终交汇点，它的主要作用是磷酸化降解NF-κB的抑制因子，促进NF-κB发生核移位。吡咯烷二硫氨基甲酸第四军医大学硕士学位论文 (pyrrolidine dithioearbamate，pDTe)是一种抗氧化剂，具有重要的细胞保护作用和抗炎作用。近期研究表明，PDTC可通过降低组织中NF一虑的活性，减少目的基因的转录，从而遏制细胞因子和炎症介质的大量释放，发挥对急性肝损伤的保护作用。但PDTC是如何影响NF一沼的活性以及对NF一妞活化通路的上游因子的作用研究尚未见报导，本实验试图从与NF一虑活化最密切的IKK一p入手，进一步探讨PDTC的抗炎机理。 本实验通过HIR和内毒素(ET)双重打击制备大鼠急性肝脏损伤(ALI)模型，观察肝脏组织中IKK.旦的表达、NF一妞的活化情况以及NF一沼的下游因子TNF产一a及IL一6的表达，探讨IKK一日、NF一沼在HIR致ALI的病理机制中的作用:同时观察PDTC对ALI的保护作用，从分子水平探讨PDTC的抗炎机理，以证实干预IKK一NF一沼信号通路可能是防止HIR后ALI的发生发展一个有效的途径，为临床HIR后ALI的预防和治疗提供实验基础。 方法:试验选择Wister大鼠随机分为:对照组(A组):HIRE组(B组);HIRE+PDTC组(C.组)。每组20只。手术方法:采用乙醚吸入麻醉，腹部正中切口，显露肝左叶及肝中叶肝动脉和门静脉。B组用无损伤动脉夹阻断肝左叶及肝中叶之入肝血流，缺血时间为lh，阻断开放时自阴茎背静脉注射大肠杆菌脂多糖(LPs)2.5 mg·kg一，;e组先经阴茎背静脉注射PDTe 120 mg·kg-‘后立即依B组方法致伤;A组仅行腹部正中切口，显露肝中叶及肝左叶肝蒂，不阻断，阴茎背静脉注射无菌生理盐水Inil。分别于再灌注后1，3，6，12h四个时间点处死动物，取材(每时间点5只)。分别采用原位杂交(IsH)、非变性凝胶迁移电泳(EMSA)及免疫组化(IH)法检测肝脏组织中IKK一p表达、NF一沼活性、TNF一a及IL一6的表达，并检测血浆中ALT含量，苏木精一伊红(HE)染色光学显微镜下观察肝脏组织病理变化。 结果:(1)I KK一p mRNA原位杂交阳性产物呈紫蓝色颗粒，第四军医大学’硕士学位论文图象分析结果:在HIRE后，B组肝脏组织中IKK一e mRNA的表达增加，3h达到峰值，与A组比较，各时间点均有显著差异 (尸<0.01);C组IKK一日mRNA的表达依然高于A组(P<0.01)，但与B组比较有明显下降，分别于lh，6h及12h有统计学意义 (P<0.05)。(2)在HIRE后，B组肝脏组织中NF一沼活性增加，3h达到峰值，与A组比较均有显著差异(尸<0.01);C组NF一沼活性依然高于A组(尸<0.01)，但与B组比较有明显下降(尸<0 .01)。(3)TNF一a和IL一6免疫组化阳性产物呈棕黄色颗粒，图象分析结果:B组动物肝脏组织中的TNF一a和.IL一6表达明显增加，3h达到峰值，与A组比较均有显著差异(尸<0.(〕1);C组TNF一a和IL一6表达依然高于A组(P<0.01)，但与B组比较有明显下降，在lh、6h、12h三个时间点有统计学意义(尸<0.05)。(4)B组损伤后动物血浆中ALT含量较A组明显增加，C组动物血浆中ALT含量较B组降低，分别在lh，6h和12h有统计学意义(p<0.05)。(5)HE染色病理检查提示:B组动物各时间点肝脏组织缺血明显，lh出现不同程度的炎症反应，6h炎症反应明显加重，肝细胞不同程度肿胀变性和空泡样变性，部分可见点状坏死及局灶性片状坏死，可见较多炎症细胞，12h炎症细胞浸润明显减少，但组织水肿仍较明显。C组组织炎症细胞浸润减少，变性坏死减轻。A组肝脏组织未见异常变化。 结论:(l)机体受到HIR和ET刺激后，可增加IKK一p的表达，促进NF一沼的活化和核移位，从而上调TNF一a的基因转录;TNF一a作为细胞因子网络的启动因子，进一步引起IL一6等一系列炎症介质的继发性释放，诱发ALI。说明IKK一p是肝脏缺血再灌注损伤的关键环节;TNF一a在炎症瀑布反应的启动中发