病毒性疾病,尤其是传染性病毒疾病,严重危害着人类的生命安全及社会活动的有序进行。了解病毒对宿主细胞的侵染机制与致病机理,有利于病毒防治药物的开发,从而从源头上阻断病毒疾病的发生。单病毒示踪技术着眼于探索单个病毒颗粒与宿主细胞之间复杂的动态相互作用,可以实现对病毒侵染过程的每个关键步骤进行实时示踪,为成功揭示病毒侵染机理提供了条件。然而,传统的利用荧光染料和荧光蛋白标记病毒的方法存在着荧光强度低、抗光漂白性差等缺点,难以实现单病毒的长时间可视。而利用量子点这种具有优异发光特性的无机荧光纳米材料标记病毒,可以实现对单个病毒侵染宿主路径和行为的长时间示踪,有利于深入了解病毒侵染机制。本文即以一种典型的囊膜病毒,呼吸道合胞病毒(RSV)为研究对象,针对病毒侵染过程中的关键事件,首先建立了一系列量子点标记病毒的方法,然后将其用于活细胞内病毒输运途径的实时分析中。主要研究内容包括以下两个方面：1.呼吸道合胞病毒的高效量子点标记(1)利用病毒在组氨酸标签修饰的细胞内的自组装过程原位标记呼吸道合胞病毒。标记策略的基础是呼吸道合胞病毒在宿主细胞膜上装配和释放时细胞表面会表达大量病毒的膜蛋白。利用EDC/NHS对含组氨酸标签(His-tag)的多肽羧基端进行活化后,可使其与处于细胞表面的病毒膜蛋白上的氨基共价结合,实现对病毒膜蛋白的His-tag标记,当病毒从此细胞出芽后即可带上His-tag。次氮基三乙酸-Ni (NTA-Ni)修饰的QDs可通过Ni与组氨酸标签的螯合作用与该病毒结合,从而实现对病毒的量子点标记。对病毒免疫荧光与量子点荧光成像的共定位分析显示有71.5±4.1%的病毒能被量子点标记上,说明该方法具有较高的标记效率。并且我们发现利用此原位标记方法获得的QDs标记病毒,比直接对活病毒修饰His-tag及偶联QDs获得的标记病毒感染力高455倍左右,说明此原位标记方法有利于获得高感染力的标记病毒。(2)利用生物素化的宿主细胞膜蛋白及核酸染料对病毒进行原位双标记,以监测病毒进入宿主的早期事件。根据囊膜病毒出芽时一些宿主细胞膜蛋白会掺入成熟的病毒体中的特点,我们提出了一种利用宿主的膜蛋白对呼吸道合胞病毒进行标记的策略。首先通过直接将细胞与生物素化试剂孵育来使细胞膜蛋白被修饰上生物素分子。然后让病毒感染该生物素化的细胞,并在其中增殖,当成熟的病毒在宿主中组装并最终在细胞膜表面释放时,生物素化的宿主膜蛋白可以自然地嵌入病毒囊膜中。此外,在病毒扩增过程中外加可绑定RNA的核酸染料可以使病毒的RNA也可以同时被标记上,实现对病毒内外组分的原位同时标记。由于病毒表面的生物素分子与链霉亲和素修饰的量子点能高效率的结合,使病毒的量子点标记效率可以达到83.7±4.6%。同时由于生物素修饰的是细胞膜蛋白,避免了对病毒表面活性位点的占据,使得量子点标记后的病毒仍可以保持95.4%的感染力。最后,通过荧光成像实时监测量子点与核酸染料双色标记的单个病毒对细胞侵染的早期行为,我们对病毒进入细胞的动力学过程及核酸在靠近细胞膜区域的快速释放过程进行了分析。(3)基于病毒自组装过程的双色量子点标记病毒。由于量子点具有较宽的激发光谱和窄而对称的荧光发射峰,同时使用不同发射的量子点不会产生光谱重叠,因此非常适合用于多色标记成像。而已建立的量子点标记病毒的方法均只使用了单色量子点。为了更好地对病毒内外组分进行长时间成像示踪,我们设计了一个对病毒囊膜蛋白和核酸同时进行量子点标记的方法。对病毒核酸的标记基于一个红色量子点-分子信标基因探针,它可以与病毒基因组中的一段重复序列杂交,由于信标一端带有猝灭基团,使其成为一个由病毒基因组触发的荧光开关。我们在病毒复制过程中通过膜通透试剂将该基因探针引入被感染细胞的细胞质,使其与病毒基因组中对应序列进行杂交,实现对病毒基因组的荧光标记。对病毒膜蛋白的标记是通过将病毒表面糖蛋白生物素化,再连接链霉亲和素偶联的绿色荧光量子点。两个标记步骤均是利用了病毒在宿主细胞内的自组装过程,并在其大量复制准备出胞时进行的。与其他病毒标记方法相比,我们这种标记策略温和、对病毒感染力影响较小,并且可以适用于所有从细胞质膜出芽的囊膜病毒的标记。2.实时示踪量子点标记的呼吸道合胞病毒在活细胞内的动态输运途径我们通过对量子点标记病毒的长时间荧光监测,及其与细胞内多种蛋白和细胞器的荧光共定位分析,并结合药物抑制实验,仔细研究了呼吸道合胞病毒对宿主细胞侵染过程。研究结果显示该病毒的内在化是一个快速而高效的过程,且主要包含三个关键事件：1)发动蛋白和小窝蛋白／脂筏介导的病毒内在化；2)微丝依赖的病毒运输过程；3)微管依赖的病毒快速运输过程及其在内质网的积累。此外,该研究结果同时也表明,我们的量子点标记策略不仅不会影响病毒的内在化途径,还有助于直观地研究病毒侵染过程。综上所述,本文利用囊膜病毒在宿主细胞中的增殖和自组装过程,建立了对于病毒内外组分的量子点标记方法,并将其用于对病毒侵染宿主过程的实时示踪分析。本文提出的原位标记策略避免了对活病毒的直接操作,大大降低了量子点标记对病毒感染力的影响,并且实现了对病毒囊膜和核酸的双色量子点标记,有望对纳米材料标记成像策略提供新思路,并拓展无机荧光纳米材料在生物成像领域的应用。