柑橘木虱Diaphorina citri是传播柑橘黄龙病病原菌“CandidatusLiberibacter asiaticus”的最主要媒介昆虫,而柑橘黄龙病乃柑橘植株上的一种毁灭性病害,危害极大。针对柑橘黄龙病不断扩散成灾,且至今尚未发现有任何化学药剂能够有效防治柑橘黄龙病的情况下,研究新型关键防治技术有效控制柑橘木虱的扩散传播,已成为目前有效控制柑橘黄龙病田间传播与蔓延的最关键性措施。害虫行为调控技术是在21世纪初由害虫生态控制理论所重点提出的一类最新害虫生态控制技术,也是将来寻找可持续害虫防控措施的一个新的突破口。在所有昆虫行为研究过程中,植食性昆虫对其寄主植物的寄主选择行为是昆虫与植物关系中的一个核心问题,其研究基础的扎实与否往往会影响到后续与之相关的害虫行为调控技术的进一步开发与利用。与大多数其他昆虫一样,柑橘木虱也会首先综合利用其嗅觉和视觉感受系统来初步辨别寄主植物,然后在其运动系统和味觉感受系统的支撑下,进而完成其整个寄主选择行为过程。然而,至今国内外仍少见有关于柑橘木虱成虫寄主选择行为过程中的影响因素、化学感觉器机理以及其嗅觉和味觉感受分子机理方面的研究报道。本研究旨在进一步深入阐明柑橘木虱的寄主选择行为机理,可为后续开发与之相关的害虫行为调控技术和在生产中协同防治柑橘木虱提供理论依据与技术支撑。主要研究结果如下:(1)柑橘木虱成虫寄主选择行为的影响因素分析。通过对比分析在不同光照强度条件下柑橘木虱成虫寄主选择行为的测定结果,结果表明柑橘木虱雄虫和雌虫的寄主选择行为均随着光照强度的增加而显著增强。在1000 lx光照强度条件下,柑橘木虱雄虫和雌虫在4 h内最终降落在寄主植物上的最高百分率分别为28.89±5.88%和35.56±4.44%;而在1 lx光照强度条件下,其二者最终降落在寄主植物上的最高百分率仅分别为11.11±3.85%和15.56±3.85%。通过对比分析在不同运动能力条件下柑橘木虱成虫寄主选择行为的测定结果,结果表明当切除柑橘木虱成虫的后足,使其丧失后足的运动能力后,对柑橘木虱成虫寄主选择行为的影响最大;其次为切除柑橘木虱成虫的前足或前、后翅;而当切除柑橘木虱成虫的中足时,对其寄主选择行为的影响最小。当切除柑橘木虱成虫的后足后,仅分别有20.00±3.85%和17.78±5.88%(分别约为对照组的1/4和1/5左右)的柑橘木虱雄虫和雌虫能够在4 h内到达风洞装置的半程区,且无任何柑橘木虱成虫能够最终降落到寄主植物上。通过对比分析柑橘木虱成虫对不同生长期寄主植物原位挥发物的趋性反应测定结果,结果表明柑橘木虱雄虫和雌虫均对出苗10 d后的九里香幼苗原位挥发物不表现出显著趋性反应,且柑橘木虱雄虫还对0.5年生的砂糖橘幼苗原位挥发物不表现出显著趋性反应。另外,通过进一步对比分析使用仿真寄主植物模型或透气滤纸罩罩住寄主植物后,柑橘木虱成虫寄主选择行为的测定结果,结果表明在风洞装置的1.5 m范围内,柑橘木虱成虫不仅能够通过嗅觉定向(寄主植物挥发物)而降落在寄主植物上,而且还能够通过视觉定向(寄主植物的形态和颜色)而降落在寄主植物上,尽管其二者最终降落在仿真寄主植物模型上的百分率均为零,但在整个过程中也分别有最高4.44±2.22%和6.67±3.85%的柑橘木虱雄虫和雌虫曾经试探性的降落到仿真寄主植物模型上。据此,推测寄主植物的形态和颜色可能是在有光照条件下影响柑橘木虱成虫最终是否进一步降落到寄主植物上的关键性因素之一。(2)柑橘木虱成虫寄主选择行为的化学感觉器机理初步研究。通过扫描电镜观察发现,柑橘木虱成虫的触角及其各足部附节和前跗节上均分布着大量的化学感觉器,但分布在其各足部附节和前跗节上的化学感觉器种类(1种或2种)均显著少于分布在其触角上的化学感觉器种类(5种)。当使用化学法分别对其成虫触角或各足部附节和前跗节上的化学感觉器进行祛除处理后,发现除了中足处理组,其他各处理组在4 h内最终降落在寄主植物上的最高百分率均显著或极显著低于对照组,且其中足处理组也发生了明显下降。其中,当使用5 mol/L的HCl分别对其成虫触角或各足部附节和前跗节上的化学感觉器进行祛除处理后,柑橘木虱成虫触角处理组、前足跗节处理组和中足跗节处理组在4 h内最终降落在寄主植物上的最高百分率分别为15.56±2.22%、8.89±4.44%和15.56±5.88%,而对照组最终降落在寄主植物上的最高百分率为33.33±3.85%。这表明,当使用化学法对其各部位的化学感觉器进行祛除处理后,均会对柑橘木虱成虫的寄主选择行为过程产生明显影响。且同时也发现,当使用5 mol/L的HCl分别处理柑橘木虱成虫的后足跗节和前跗节后,大多数的柑橘木虱成虫均会因5 mol/L的HCl处理而丧失基本运动能力,从而彻底切断其整个寄主选择行为过程。据此,推测在生产上或许可以通过利用化学药剂处理的方法使柑橘木虱成虫丧失运动能力,从而进一步减少其对柑橘黄龙病的传播。另外,通过仿真寄主植物模型的对比研究还发现,所有处理组的柑橘木虱成虫均会先试探性的降落在仿真寄主植物模型上。然而,只要其成虫的触角不被5 mol/L的HCl处理,柑橘木虱成虫在经试探性的降落到仿真寄主植物模型上后便会立即飞离仿真寄主植物模型;仅有柑橘木虱成虫的触角处理组在经试探性的降落到仿真寄主植物模型上后,才不会再飞离仿真寄主植物模型。这表明,柑橘木虱成虫不仅可以通过其触角上的各类化学感觉器完成对寄主植物的远距离嗅觉定向,而且在降落到寄主植物上后,其触角上的各类化学感觉器还有可能进一步参与到寄主植物近距离体表化学刺激因子的判定过程,从而在最终决定寄主植物的取舍过程中发挥着重要作用。(3)柑橘木虱成虫化学感受蛋白基因的克隆与表达分析。通过对柑橘木虱成虫的转录组数据进行比对分析及PCR验证,共获得1个OBPs气味结合蛋白基因和6个CSPs化学感受蛋白基因的cDNA片段。进一步通过利用RACE扩增技术和基因克隆测序,则分别获得柑橘木虱成虫OBPs气味结合蛋白和CSPs化学感受蛋白基因的全长cDNA序列各1条,并分别命名为DcitOBP1(GenBank登录号为:KY475564)和DcitCSP1(GenBank登录号为:KY475563)。其中,DcitOBP1气味结合蛋白的分子大小为:15.8 kDa,理论等电点是9.12,预测半衰期理论值为30 h,不稳定参数为34.98,而脂溶指数与总平均亲水性分别为84.46和-0.050;DcitCSP1化学感受蛋白的分子大小为:14.9 kDa,理论等电点是8.2,预测半衰期理论值为30 h,不稳定参数为50.68,而脂溶指数和总平均亲水性分别为86.80和-0.507。随后,通过利用RT-qPCR检测还发现,DcitOBP1气味结合蛋白基因仅在柑橘木虱雄虫和雌虫的触角组织中高表达,而在其他各组织中分布很少,这暗示着DcitOBP1气味结合蛋白可能主要在柑橘木虱成虫触角的嗅觉感受过程中发挥着重要作用。然而,DcitCSP1化学感受蛋白基因则在柑橘木虱成虫的各个组织中均有不同程度的分布,其不仅在柑橘木虱成虫的触角组织中存在,而且还在其非感受器官组织中也有发现,这暗示着DcitCSP1化学感受蛋白基因可能执行着包括嗅觉以外的其他各种不同的生理功能。(4)柑橘木虱成虫化学感受蛋白的原核表达及其配体结合能力分析。为了进一步探明柑橘木虱成虫OBPs和CSPs参与其嗅觉和味觉识别过程中的分子机理,以及其与12种待测的寄主植物特征挥发物间的结合特性。在本实验中,首先通过利用PET-32a(+)原核表达载体对上一步中克隆测序所得到的柑橘木虱成虫DcitOBP1气味结合蛋白和DcitCSP1化学感受蛋白进行原核表达,SDS-PAGE电泳分析显示这两种原核表达的重组融合蛋白均以可溶性的形式出现,并经Western blot成功验证为目的蛋白。分离纯化后,利用重组肠激酶rEK切除重组融合蛋白的His-Tag表达标签,然后采用荧光竞争结合实验的方法分别测定了这两种重组融合蛋白对12种待测的寄主植物特征挥发物的结合能力。随后,再利用分子模拟对接的方法进一步对荧光竞争结合实验结果进行验证。验证结果表明,DcitOBP1气味结合蛋白与12种待测的寄主植物特征挥发物的结合能力较强,而DcitCSP1化学感受蛋白的结合能力则相对较弱。根据结合常数显示DcitOBP1气味结合蛋白与α-石竹烯和β-石竹烯均有较强的结合能力,其中按强弱顺序依次为:α-石竹烯、β-石竹烯、β-榄香烯、右旋-α-蒎烯、左旋-α-蒎烯、α-水芹烯、柠檬烯、芳樟醇、3-蒈烯、β-罗勒烯、月桂烯、水杨酸甲酯。据此,推测柑橘木虱成虫DcitOBP1气味结合蛋白可能是感知具有引诱活性气味化合物的重要气味结合蛋白。