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前言肝门阻断（hepatic portal occlusion，HPO）是肝移植和肝脏手术中重要的一种减少出血的手段。HPO后并存肝的缺血再灌注损伤和肠道的淤血再灌注损伤，也是围麻醉期间所有病理生理改变的根源。不仅有肝肠原位损害还伤及远隔脏器。肝移植术后神经精神并发症发生率高达8～47％（平均20％），其发病机制尚未明确。以往的研究多集中于免疫抑制剂的神经毒副作用。国内外对肝门阻断再灌注后直接的脑损伤尚无深入的研究。本课题组先前的研究表明肝缺血再灌注后BBB中紧密连接（tight junction）受损后通透性增加，同时氧源性因素攻击下产生脑损伤。本研究拟通过建立大鼠非转流肝门阻断模型模拟无肝期过程，研究再灌注后大脑皮层形态学、中枢神经损伤特异性生化标志物、兴奋性氨基酸及其特异性受体表达的改变，从细胞、蛋白、神经递质和基因水平上探讨损害的细胞内、外机制；同时应用远程缺血预适应作为干预措施研究能否为HPO模型提供脑保护，以期减少神经系统并发症。本研究分为三个部分：一、肝门阻断再灌注后中枢和外周S100β蛋白的差异性改变及意义；二、肝门阻断再灌注后脑皮层兴奋性氨基酸及NMDA受体mRNA表达的改变；三、肢体缺血预适应减轻肝门阻断再灌注后脑皮层EAAs及NMDA受体表达的增加。实验材料与方法一、实验材料1、实验动物健康雄性Wistar大鼠，体重200～250g。2、主要试剂及药品S100β蛋白ELISA试剂盒（大连泛邦生化技术公司提供产品）；Glu和Asp标准品（SIGMA公司）；总RNA提取试剂盒（天泽基因工程公司提供）；TaKaRa PCR试剂盒及DNA Marker等（大连宝生物公司提供）；NMDAR1、NMDAR2B、β-actin引物（北京三博远生志生物技术公司合成）；MPO试剂盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗大鼠NMDAR2B一抗（美国Biosouse公司）。3、主要仪器Datex多功能监测仪（芬兰）；RBP-1B型大鼠血压计（北京）；PHILIP M3562A血气分析仪（德国）；LKB-V超薄切片机（瑞典）；Olympus显微镜（日本）；深低温冰箱（美国Foma）；HEIDOLPH DLAX900匀浆机（德国）；UPSOH超声波粉碎机（德国）；S-500P紫外光可见光连续分光光度计（法国）；ELX-800酶标仪（美国Bio-Tech Instrument）；高速冷冻离心机（美国）；孵育箱（上海）；PTR—IOOPCR扩增仪（美国）；通用BIO-RAD PowerPac 200电泳仪（美国）；水平板电泳仪（上海）；KODAK ID型凝胶成像分析系统（美国）；日立HITACHI H-600透射电镜（日本）；岛滓SCL-10AVP高效液相色谱仪（日本）；半干转印仪（美国）；水平摇床（上海）。二、实验方法1、动物模型大鼠异氟烷吸入麻醉，参照Pringle方法，通过夹闭肝门后开放建立大鼠肝门阻断再灌注模型。2、实验分组Sham组：假手术组，开腹分离肝动脉、门静脉和胆管后关腹。HPO组：全肝缺血30min后再灌注6h、12h、24h。LIP组：在前两部分实验的基础上建立LIP预处理，先行下肢缺血10min后再灌注30min，继以HPO 30min后再灌注6h。3、观察指标和方法①围缺血期HR、MAP变化；②再灌注后脑组织病理检查（光镜）；超微结构的检查（电镜）；③门脉开放前后门静脉血pH、[K+]、[Ca2+]（血气分析）；④回肠组织MPO活性测定（化学比色法）；⑤脑组织和血清中S100β蛋白含量的改变（ELISA法）；⑥脑组织中Glu、Asp含量变化（HPLC法）；⑦脑组织NMDAR1mRNA和NMDAR2BmRNA表达的变化（RT-PCR法）；⑧脑皮层组织NMDAR2β的蛋白表达（WesternBlot法）。实验结果一、肝门阻断再灌注后中枢和外周S100B蛋白的差异性改变1、基本参数：①血压变化：Sham组实验期间血液动力学稳定，HPO组肝门阻断期降低；再灌注后有一过性血压下降，心率增快。各组均保持在60mmHg以上。②HPO期间门静脉pH显著降低，[K+]升幅超过1倍，但开放后6h时已经恢复；[Ca2+]于再灌注后持续下降至12h。2、光镜下HPO组再灌注后肠道病理改变重于肝脏本身。肝细胞索、肝窦分界不清，气球样变性多见，灶性坏死；小肠粘膜表面糜烂，炎症渗出，PMN细胞聚集，可见血管内皮损伤。而Sham组肝细胞肝窦形态结构正常；小肠组织结构正常。3、脑皮层形态学：①光镜：HPO组再灌注6h后皮层神经细胞较为稀疏，间质水肿，见血管内皮损伤，周围组织有明显空亮水肿。②电镜下再灌注后6h超微结构损害较为严重，脑组织水肿，以胶质细胞和毛细血管周为重；胶质细胞变性；血管周围神经突起水肿，崩解。4、和Sham组比较，再灌注12h时HPO组皮层组织中S100β蛋白升高显著（P＜0.05），6h和24h未见显著差异（均P＞0.05）5、血清S100β蛋白各组的的差异未见统计学意义（均P＞0.05），但HPO再灌注后各时点均有浓度超过0.2μg／L的个例数。组织和血清两种S100β蛋白未见相关性。二、肝门阻断再灌注后脑组织兴奋性氨基酸及NMDA受体mRNA表达的改变1、天门冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）Sham组变化均未见差异。与其同时点比较，HPO组再灌注后6h明显升高（P＜0.05），12h和24h差异不显著（均P＞0.05）。同时见HPO组12h时较6h下降（P＜0.05），24h则没有差异（P＞0.05），整体呈下降趋势。2、NR1、NR2B的mRNA基因表达Sham组各时点变化未见差异。HPO组NR1mRNA在再灌注后6h，12h，24h较Sham同时点均显著升高（均P＜0.05），HPO组间比较显示12h升幅更大，24h下降接近6h水平。NR2BmRNA在再灌注后6h表达显著升高（P＜0.001），而后逐渐下降。二者24h均恢复至对照组水平（均P＞0.05）。三、肢体缺血预适应减轻肝门阻断再灌注后脑皮层EAAs及NMDR表达的增加1、模型生存率Sham组100％存活，HPO组生存率大幅降低仅为30.8％，LIP组能显著提高存活率达到58.6％，组间的差异有统计学意义（P＜0.05）。2、形态学①光镜下HPO组小肠组织和肝脏均见损伤，LIP组的损伤较轻。②电镜下，LIP组脑组织细胞改变趋势轻于HPO组。3、小肠MPO活性HPO组的MPO活性高于Sham组，LIP组低于HPO组（均P＜0.05），但仍高于Sham组（P＜0.05）。4、EAAs和Sham组比较，再灌注后HPO组的Glu、Asp和总量均明显升高（均P＜0.05），LIP组接近Sham组水平（均P＞0.05）。但LIP组Glu的升幅显著低于HPO组（P＜0.05），EAAs总量也较低（P＜0.05）。5、NMDAR亚单位NR2B蛋白表达HPO再灌注后脑皮层细胞NR2B蛋白表达较Sham组明显增加（P＜0.05），LIP组的蛋白表达升幅减少（P＜0.05），但高于Sham组（P＜0.05）。结论1、肝门阻断再灌注后并存肝和肠道损伤，且见肠道损伤更重。2、肝门阻断再灌注后可致大脑皮层损伤性改变，但脑损害有一定的发生率。3、肝门阻断再灌注后脑皮层神经胶质细胞在应激条件下S100β蛋白表达增加，但和血清S100β蛋白变化趋势未见明显相关性。4、肝门阻断再灌注过程可启动神经突触间Glu和Asp的堆积，同时上调NMDARmRNA的表达。5、肢体缺血预适应能够为肝门阻断再灌注后的脑组织提供远程保护作用。