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背景黑色素瘤(Malignant melanoma,MM),是来源于神经嵴黑色素细胞的高度恶性肿瘤,常见于皮肤和其他器官黏膜,早期即可发生局部和远处转移,恶性程度高,进展迅速,总体中位生存期仅7.5个月,预后差,病死率高。近年来,其发病率在世界各地都呈上升趋势,成为排在首位的皮肤致死类疾病,且根据流行病学调查,我国皮肤黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma,CMM)的发病率及死亡率也呈上升趋势。在治疗上,目前主要是靠手术切除为主,术后辅以放化疗等治疗措施,分子靶向治疗等也在临床上应用来尝试改善患者的生存期,且关于黑色素瘤基础和临床研究的探索不断增多,但其发病机制仍然未明,也缺乏早期的诊断方法,很多患者确诊时已经是中晚期。临床治疗上无显著进展,现状仍不容乐观。因此,进一步探索黑色素瘤发生和发展的相关机制,寻找新的肿瘤标志物以及治疗靶点,为进一步提高黑色素瘤的早期诊断、治疗,监测其复发、转移,是目前基础研究的方向与目标之一。中介因子复合体(Mediator,Med)是由多个蛋白质亚基组成的生物大分子结构复合物,已证实有促进细胞外转录的激活、增强基础转录、促进CTD(聚合酶大亚基羟基端结构域carboxy terminal domain)磷酸化的功能,在调节细胞生长、分化和凋亡的各个过程中直接或间接发挥着作用。中介体复合物亚基19(Mediator 19,Med19)是其一个亚基,位于染色体上11q12.1位置,在人类编码的基因名为LCMR1(肺癌转移相关蛋白,Geb Bank编号AAN16075),相关研究表明,Med19在肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等多种人类肿瘤中表达增高,涉及到多种肿瘤的形成及发展过程。改变细胞中某种蛋白的表达量,是研究该蛋白在细胞中作用的常用科研思路。既往关于Med19基因在恶性肿瘤恶性生物学行为,如增殖、凋亡、分化、侵袭方面的研究,为肿瘤的基因治疗提供了一条新的治疗思维。RNAi干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double stranded RNA,ds RNA)诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,被大量运用于探索基因功能、传染性疾病、恶性肿瘤的治疗。国内外已有大量研究证明利用RNAi技术沉默Med19基因抑制人乳腺癌细胞、人肺癌A549细胞等肿瘤细胞以探明干扰后对其增殖、凋亡、侵袭、转移等的影响,为这些恶性肿瘤的治疗提供了新的治疗思路。而关于Med19基因与皮肤黑色素瘤的相关研究,目前未见相关报道。因此,本研究旨在通过免疫组织化学方法,检测Med19在皮肤黑色素瘤组织、癌周正常组织中的不同表达,并研究其表达水平与黑色素瘤恶性表型的相关性;应用Med19siRNA转染黑色素瘤A375细胞后,通过RT-PCR方法检测Med19 m RNA在A375细胞中的表达水平,并利用MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡,探讨其与皮肤黑色素瘤发生的相关性。第一部分Med19在皮肤黑色素瘤组织中的表达及意义目的:研究Med19蛋白在皮肤黑色素瘤组织、癌周正常组织中的表达,并分析其与患者临床参数的相关性。方法:1.应用免疫组织化学方法检测Med19蛋白在皮肤黑色素瘤组织、癌周正常组织中的表达。2.应用统计学方法对Med19蛋白的表达量与患者临床参数进行综合分析。结果:1.应用免疫组化检测52例皮肤黑色素瘤和20例癌周正常组织中Med19蛋白表达情况,结果显示:52例皮肤黑色素瘤组织中的Med19阳性蛋白表达86.54%(45例),而20例癌周组织中Med19蛋白阳性表达为15.0%(3例),差异有统计学意义(P<0.05)。2.Med19蛋白在皮肤黑色素瘤组织中的表达水平高于癌周正常组织,且在发生淋巴结转移、TNM分期较晚的患者组织中的表达高于未发生转移、TNM分期较早的患者,差异具有显著性(P<0.05)。与患者年龄、性别、原发灶溃疡有无等无显著相关性(P>0.05)。在皮肤恶性黑色素瘤组织中的表达水平高于癌周正常组织,差异具有显著性(P<0.05)。结论:1.在皮肤黑色素瘤组织中Med19蛋白表达较癌周正常组织明显上调,提示Med19可能参与了皮肤黑色素瘤的发生发展。2.Med19在皮肤黑色素瘤表达在发生淋巴结转移、TNM分期较晚的患者组织中的高于未发生转移、TNM分期较早的患者(P<0.05),差异具有统计学意义,提示Med19可能与黑色素瘤的生物学行为有关。第二部分Med19表达对黑色素瘤A375细胞生物学行为的影响目的:在第一部分实验中,观察到Med19皮肤黑色素瘤组织、癌周正常组织中均有表达,且皮肤黑色素瘤组织中Med19蛋白表达较癌周正常组织明显上调,统计分析证实表达量与淋巴结转移、TNM分期呈正相关,而与患者性别、年龄等无关,提示Med19可能与黑色素瘤的生物学行为相关。本部分拟通过siRNA沉默A375细胞中Med19基因,应用RT-PCR检测Med19 m RNA的表达,并通过MTT、细胞凋亡实验,观察沉默Med19基因对黑色素瘤A375细胞增殖、凋亡的生物学行为的影响。方法:1.通过siRNA沉默Med19表达,应用RT-PCR检测黑色素瘤A375细胞Med19m RNA的表达水平。2.通过增殖实验检测Med19沉默对黑色素瘤A375细胞增殖的影响。3.通过流式细胞术检测Med19沉默对黑色素瘤A375细胞凋亡的影响。结果:1.A375细胞siRNA转染后可抑制Med19基因m RNA的表达。2.Med19基因沉默对黑色素瘤A375细胞的增殖具有显著性抑制作用。3.Med19基因沉默可引起黑色素瘤A375细胞明显的凋亡。结论:siRNA可有效沉默黑色素瘤A375细胞Med19基因的表达,沉默Med19基因可以明显诱导A375肿瘤细胞凋亡,抑制其生长,细胞增殖能力减弱,表明Med19参与了黑色素瘤发生、发展的不同时期,有望成为黑色素瘤临床诊断、分期的重要依据,并可作为新的肿瘤治疗靶点。