口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病毒主要感染牛、羊等偶蹄动物并可造成严重的经济损失。目前,我国国产的FMDV疫苗均是由灭活口蹄疫病毒,配用油佐剂制备而成,临床副反应大,免疫保护还有待进一步提高,同时在疫苗生产过程中存在灭活不完全而造成强毒逃逸的风险。因此,选择有效表面展示系统,利用基因工程技术展示FMDV抗原表位,进而制备FMDV亚单位疫苗,对于提升国产疫苗质量及安全性,具有很大的实际应用价值。VP1蛋白是FMDV主要的抗原,它含有的GH环第141-160位氨基酸为线性B细胞抗原表位,也是诱导机体产生中和抗体的免疫表位,可以诱导产生保护性免疫应答,因此是研究口蹄疫疫苗的理想抗原,基于口蹄疫VP1蛋白GH loop表位的合成肽疫苗目前在国内已成功上市。PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒表面展示系统是国内外近年发展起来的一种外源抗原表位展示系统。该技术是利用外源肽段取代Cap蛋白内部的loop环,表达重组Cap蛋白,然后60个重组Cap蛋白可在体外自我组装为病毒样颗粒完成对外源抗原表位的展示。霍乱毒素B亚单位展示系统是利用外源抗原表位采取同源重组技术替换霍乱毒素B亚单位中KNG氨基酸基因片段,表达重组CTB蛋白,然后5个重组CTB蛋白可在体外聚集为五聚体结构进而完成对外源抗原表位的展示。本研究选择了 PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒及霍乱毒素B亚单位作为展示FMDV抗原表位的载体系统,成功展示FMDV VP1的GH loop抗原表位,并以此为基础制备了 FMDV-PCV2二联亚单位疫苗及FMDV亚单位疫苗,初步评价其免疫保护效力,为研制高效FMDV疫苗奠定了良好的基础。本文主要研究内容如下:1.基因替换构建以PCV2 Cap为骨架展示FMDV GHloop的嵌合VLPs本试验以O型FMDV VP1主要B细胞表位GH loop为外源基因,在PCV2 Cap蛋白内部鉴定获得4个位置,以基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中成功诱导表达,SDS-PAGE鉴定表明,获得的重组蛋白大小分别为27 kDa左右,均为可溶性蛋白;Western-bloting分析显示,6种重组蛋白均能与PCV2 阳性血清及O型FMDV 阳性血清反应;透射电镜观察表明,重组Cap蛋白体外形成大量直径在20 nm左右的病毒样颗粒。50 μg/只纯化后重组蛋白自制疫苗免疫小鼠证实能够引发机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,其中以Cap-loop4免疫效果最好。2.基因插入构建以PCV2 Cap为骨架展示FMDV GH loop的嵌合VLPs在前期研究基础上依次将FMDV GH loop基因片段插入PCV2 Cap蛋白内部鉴定获得4个位置处,以基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中成功诱导表达。SDS-PAGE鉴定表明,获得的重组蛋白大小分别为35 kDa左右,均为可溶性蛋白;Western-bloting分析显示,4种重组蛋白均能与PCV2阳性血清及O型FMDV血清呈阳性反应;透射电镜观察表明,重组Cap蛋白体外形成大量直径在20 nm左右的病毒样颗粒。50 μg/只纯化后重组蛋白自制疫苗免疫小鼠证实能够引发机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,其中以Cap-iloop1免疫效果最好。3.以CTB为载体展示FMDV GH loop抗原表位方法的研究探讨以霍乱毒素B亚单位为载体制备猪O型口蹄疫亚单位疫苗的可行性。将FMDV GH loop基因片段取代CTB氨基酸的KNG肽段基因序列,基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中诱导表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白获得高效表达且具有良好可溶性;Western-blot分析结果显示重组蛋白能够与FMDV 阳性血清发生反应;神经节苷脂GM1抗原包被板鉴定表明,重组CTB蛋白能够形成五聚体结构;200 μg/头份重组蛋白制备疫苗免疫试验猪能够产生较高的抗体水平与细胞免疫反应。以上结果表明重组蛋白具有针对FMDV良好的免疫原性,为研究口蹄疫亚单位疫苗提供了新思路。