第一部分Plectin1双模态靶向分子探针的构建及性能表征　　目的：　　合成氨基化磷脂聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子(NH2-PEG?SPIONs)，进而构建基于胰腺癌Plectin1的荧光、MRI双模态靶向胰腺癌的分子探针（anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）。并对该磁性纳米粒子和分子探针的性能进行表征。　　材料与方法：　　1、氨基化磷脂聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子（NH2-PEG?SPIONs）的合成：　　1.1油溶性磁性纳米粒子（SPIONs）的合成：将适量的乙酰丙酮铁与二卞醚、油酸及油胺等溶剂混合，在氮气环境中加热至220℃，维持适当时间继续加热至290℃，1h后降至室温。在强磁场的作用下向上述所得溶液中加入乙醇重复冲洗数次，最终将SPIONs溶解于三氯甲烷（氯仿）中，室温保存。　　1.2 NH2-PEG?SPIONs的合成：取适量氨基化磷脂聚乙二醇（NH2-PEG）溶于氯仿溶液，再将适量上述SPIONs氯仿溶液与NH2-PEG氯仿溶液混合均匀后再加入去离子水，65℃水浴条件下旋蒸13分钟。将旋蒸后的水溶液置于高速离心机离心，继而行探头超声。用滤膜将上述NH2-PEG?SPIONs的水溶液滤过若干次，4℃保存备用。　　2、双模态靶向分子探针（anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）的构建：将上述步骤合成的NH2-PEG?SPIONs水溶液与MES缓冲液混匀至20ml，向混合液中分别加入2.68ml EDC溶液及4.8ml Sulfo-NHS溶液，放入恒温器中振荡混匀约30min，继而高速离心3次，每次离心间隙均用硼酸盐溶液清洗，终溶液配制成20ml的 NH2-PEG?SPIONs硼酸盐溶液。向上述溶液中加入70μl0.5mg/ml的anti-Plectin1抗体及700ug Cy7-NHS，置于摇床15℃条件下100rpm过夜反应，最终用2.2ml0.1g/ml的BSA将其封闭，置于4℃冰箱保存，过程中严格避光。　　3、磁性纳米粒子（ NH2-PEG?SPIONs）和分子探针（ anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）的性能表征：采用透射电子显微镜( TEM)观察NH2-PEG?SPIONs的形态，应用高分辨率透射电子显微镜（ HRTEM）观察NH2-PEG?SPIONs的核心粒径；检测磁性纳米粒子（NH2-PEG?SPIONs）的胶体稳定性；分别测量 NH2-PEG?SPIONs、NH2-PEG?SPIONs-Cy7及 anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7的水动力尺寸、Zeta电位；使用振动样品磁强计(VSM)、磁共振成像等检测NH2-PEG?SPIONs的磁学性质；应用NH2-PEG?SPIONs和分子探针进行健康、活体小鼠体内毒理实验。　　结果：　　TEM及HRTEM显示NH2-PEG?SPIONs的核心粒径在9nm~15nm之间，平均粒径12nm，形态均一，单分散性好；NH2-PEG?SPIONs的胶体稳定性好；振动样品磁强计(VSM)的磁性分析显示DSPE-PEG?SPIONs余磁为0，为超顺磁性材料，其饱和的磁化强度为80 emμg-1，适合作为MR成像的对比剂；体外MRI成像结果显示，随着纳米粒子NH2-PEG?SPIONs浓度的增加，T2加权成像信号逐渐降低；体外弛豫曲线测量的r2值为115.95mM/s；依次测得NH2-PEG?SPIONs、NH2-PEG?SPIONs-Cy7及anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7的水动力尺寸众数分别在28.85nm、55.80nm及84.34nm左右，均在MRI造影剂可接受粒子大小范围内；测得NH2-PEG?SPIONs、NH2-PEG?SPIONs-Cy7及anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7的Zeta电位分别为15.9mV、﹣24.8mV及﹣11.3mV，在一定程度上说明荧光材料Cy7-NHS和（或）抗体anti-Plectin1成功连接到磁性纳米粒子表面；动物体内毒理实验结果证明该磁性纳米粒子和分子探针对活体重要脏器无毒性作用。　　结论：　　本实验研制出的双模态靶向分子探针（anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）的粒径小、磁学参数理想且无明显毒理作用，体外实验结果显示磁性纳米粒子在MRI T2WI上为低信号，提示该分子探针可能是一个理想的MRI分子探针。　　第二部分双模态靶向分子探针应用于人胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型的活体荧光、MR成像研究　　目的：　　应用双模态靶向分子探针进行人胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型的荧光、MR成像，结合荧光、MR图像和病理结果，分析该双模态靶向分子探针对胰腺癌的靶向成像效果。　　材料与方法：　　1、人胰腺癌裸鼠原位移植瘤的建立：　　1.1胰腺癌皮下移植瘤的建立：将红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）转染的人胰腺癌细胞株（XPA-1-RFP）在培养液中培养，到细胞生长良好时，经处理、将细胞悬液分别注射于3只裸鼠的腹部皮下。通过动物荧光成像仪实时观察皮下肿瘤的生长情况。当皮下肿瘤生长到直径约8mm-10mm时，将肿瘤解剖、取出分割成1mm×1mm的组织块，浸于细胞培养基中备用。　　1.2人胰腺癌裸鼠原位移植瘤的建立：肌肉注射麻醉裸鼠，采用显微外科手术的方法，在正常裸鼠左下腹部相当于脾脏水平做一长度约1cm的纵形切口，剪开皮肤和腹膜，暴露胰腺，正常情况下，胰腺和脾脏紧密相连。用外科手术缝线将一块1mm×1mm大小的肿瘤组织块缝到胰腺组织上，关闭腹腔及皮肤，最后酒精消毒，置入饲养笼中继续培养。所有手术过程均在超净台内完成。于动物荧光成像仪下动态观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至1cm左右时进行 MR、荧光分子成像实验。　　2、应用靶向分子探针进行人胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型的活体MR、荧光成像：将24只荷瘤裸鼠随机分成二组：靶向（探针）组12只，非靶向（对照）组12只。先将所有荷瘤鼠均进行 MR平扫，再向靶向组、非靶向组的荷瘤裸鼠尾静脉分别注入200μl的0.5mg/ml靶向分子探针（ anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）和200μl的0.5mg/ml非靶向的荧光磁性纳米粒子（NH2-PEG?SPIONs-Cy7）。分别于注射后8h、24h、48h各时间点各组随机选取4只先后进行MR扫描和近红外荧光成像。　　3、成像扫描结束后均处死，取小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、肿瘤进行 HE染色、普鲁士蓝染色等病理检测。　　4、对比各组、各时间点荧光、MRI图像和病理检测结果，评价本实验制备的双模态靶向分子探针对对胰腺癌靶向成像效果。　　结果：　　注射探针8h、24h后普鲁士蓝染色显示肿瘤组织、尤其是周边部位有少量蓝染铁颗粒分布，MR T2WI上肿瘤组织信号未见明显变化；注射探针48h后肿瘤组织在T2WI上信号表现出不同程度的降低，此时普鲁士蓝染色结果显示肿瘤内布满大量蓝染铁颗粒，说明靶向探针能够特异性靶向到达肿瘤组织；而非靶向探针组普鲁士蓝染色结果显示肿瘤内未见明显蓝染铁颗粒。注射探针后8h、24h的近红外荧光成像图显示探针荧光主要分布于裸鼠的肝、脾区域，至48h时的近红外荧光成像图显示探针荧光大部分分布于肿瘤区域、可与肿瘤荧光相重叠。裸鼠的肝脏、脾脏在注射探针后T2WI信号明显降低，至48h时仍呈较低信号，各时间点的肝、脾普鲁士蓝染色亦显示均含不等量蓝染铁颗粒。肾脏在注射探针前后各时间点T2WI上信号无明显变化，各时间点普鲁士蓝染色显示仅含少许或无明显蓝色铁颗粒。　　结论：　　该荧光、MR双模态靶向分子探针能有效的靶向分布到裸鼠的人胰腺癌原位移植肿瘤中，引起瘤体MR T2信号不同程度的降低，其荧光成像和普鲁士蓝染色结果也证实该分子探针能分布在胰腺癌组织中，表明 anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7是一个理想的胰腺癌双模态靶向分子探针，具有良好的应用前景。但是MRI T2WI上信号变化强度较弱且易受肿瘤坏死、出血、囊变等因素的影响，应用于临床仍需要进一步大量的研究。