在脑相关疾病的药物治疗中,选择一种能高效靶向脑损伤区域的药物载体至关重要。目前常用的药物载体有脂质体、纳米粒等,近年来随着研究的推进,医药生物领域开始逐渐聚焦来自生物体自身的天然载体。其中,干细胞因其多向分化潜能和分泌功能被应用于移植治疗和组织再生,干细胞来源外泌体作为干细胞发挥分泌功能的主要工具也广受关注。缺血性脑卒中是一种具有高死亡率和高致残率的脑神经损伤疾病,针对该疾病进行靶向载体的设计,用于向脑部递送治疗药物,在提高存活率的基础上对损伤后的神经功能进行修复是治疗的关键。如何建立以干细胞/外泌体为基础的生物靶向治疗载体用于递送基因药物,使之能够对缺血性脑卒中发挥有效的治疗作用成为研究的一大热点,有望为今后临床的有效治疗提供新方案。本研究旨在针对严重缺血性脑卒中损伤后的生存率提高及神经组织修复这一难题,结合干细胞/外泌体疗法、基因药物携载等手段,构建新型生物治疗载体。研究建立携载脑源性神经营养因子(BDNF)基因的神经干细胞(NSCs)以及低氧培养NSCs分泌的外泌体两种具有治疗功能的生物靶向传递系统,分别用于缺血性脑卒中的移植治疗。首先,实验构建了一种新型活性氧(ROS)响应型非病毒基因转染体系,通过系统研究后对NSCs进行基因转染以增强其分泌BDNF的能力,用于缺血性脑卒中的治疗。另一方面,分离提取NSCs分泌的外泌体作为天然靶向生物载体用于缺血性脑卒中的治疗。为了实现更好的神经功能恢复效果,通过低氧培养NSCs对其分泌的外泌体进行膜表面性质改良及其内容物中治疗基因携载调整。而后通过体内外研究,考察了 NSCs及外泌体这两种生物载体的脑靶向性以及其携载分泌治疗物质的能力,并对其用于治疗缺血性脑卒中时生存率的提高和神经功能的恢复效果进行了探讨。为了建立安全且高效的NSCs基因转染体系,本文根据缺血损伤脑部相较正常组织高ROS的微环境构建了一种新型ROS响应型非病毒基因转染载体p-硼酸基苄溴季铵化的聚丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(B-PDEA)。以虫荧光素酶基因为报告基因,对B-PDEA在NSCs上的基因转染进行条件摸索和系统研究。结果显示B-PDEA在NSCs上可实现高效率的基因转染,相较其他常用非病毒载体如聚醚酰亚胺(PEI)、Lipofectamine 2000的转染效率提高两个数量级,同时又能保证较低的毒性。研究B-PDEA的胞内转运行为,发现B-PDEA通过网格蛋白途径入胞,由于其结构中硼酸基团的存在,能携载质粒于5 min内实现快速入胞,且在0.5 h内从溶酶体中逃逸,继而释放质粒入核进行表达。进一步考察表明,在转染后适当升高培养环境中的ROS水平,能将B-PDEA对NSCs的转染效率提高近8倍,提示该转染体系可在脑缺血损伤微环境中高效转染NSCs。继而考察了 NSCs作为生物载体用于缺血性脑卒中治疗的能力。通过尾静脉注射将NSCs移植入大脑中动脉闭塞(MCAO)模型小鼠体内,显示NSCs能集中至脑缺血损伤区域。利用B-PDEA/BDNF质粒复合物对NSCs进行转染,NSCs携载分泌治疗因子BDNF的能力显著提高,且脑靶向能力不受影响。尾静脉注射移植转染后的NSCs能显著提升MCAO模型小鼠脑内BDNF总量,同时小鼠术后28天生存率得到极大提高,从0%提高至60%以上,远超未经基因修饰的NSCs治疗的生存率(约为20%)。此外,行为学实验结果显示,移植转染后的NSCs进行治疗加速了小鼠运动和感知功能的恢复,显著缩小脑部缺血损伤范围,促进损伤组织的再生。干细胞作为一种新型生物载体,其治疗作用部分来自于分泌功能。承担细胞间信息传递的分泌囊泡——外泌体,部分保留了干细胞作为生物载体拥有天然治疗能力的优势,同时兼具安全性和可修饰性,在应用中避免了干细胞在体内迁移分化的不可控性带来的风险,且不受恶劣的疾病微环境对其治疗功能的限制。本研究采用凝胶排阻法过柱分离NSCs分泌的外泌体(EXOs),并对其进行鉴定分析。EXOs经尾静脉注射入MCAO模型小鼠体内后能集中至脑损伤部位,显示其具有与NSCs相似的脑靶向性。继而通过直接或间接的方式对外泌体进行膜表面修饰和内容物改良。首先在EXOs膜表面直接修饰靶向多肽,其靶向能力未见提高。而后对NSCs分别进行氧化铁纳米粒共孵育和低氧培养,间接修饰其外泌体。结果显示,氧化铁纳米粒与NSCs共孵育并未显著提高其外泌体膜表面与靶向能力相关的受体CXCR4表达。而低氧培养NSCs后,其外泌体(H-EXOs)在形态上无明显改变,膜表面的CXCR4表达相较EXOs确有增高,但外泌体靶向性未见提升。在模拟缺血性脑卒中损伤区域的低氧环境下培养NSCs,不仅对外泌体膜蛋白产生影响,也会改变其携载的治疗基因。对外泌体内携载的微小RNA(miRNA)进行初步测序分析,发现相较于EXOs,H-EXOs内部分miRNA发生显著上调或下调,可以分别调控有关神经再生形成突触的通路和细胞增殖组织再生的通路等。以上结果表明,通过对外泌体的来源细胞NSCs进行低氧培养,可以在保持外泌体原有基本性状不变的情况下改变其膜表面蛋白,同时能间接改变外泌体携载的生物因子种类及含量。为了考察外泌体作为新型生物载体靶向递送治疗物质用于缺血性脑卒中治疗的能力,本研究将EXOs和H-EXOs分别通过尾静脉注射移植入MCAO模型小鼠体内。结果显示EXOs相较NSCs有更为显著的提升生存率的作用,达到约70%,但在行为学实验中表现出的恢复速度和最终治疗结果不如NSCs。而H-EXOs则结合了 EXOs及NSCs在治疗中的优势,体现了运动和感知功能的修复,在促进脑部缺血损伤组织的再生和损伤范围的缩小方面也显著优于EXOs,治疗后整体恢复情况与NSCs相当,更进一步将模型动物生存率提升至约90%。本文最后基于对干细胞疗法安全性的考虑,考察了 NSCs给药毒性及致瘤性。当用1×103 cells或1×106 cells剂量的NSCs进行尾静脉注射给药后,在4周的毒性观察期内,小鼠整体无明显毒性反应,各项观察指标正常,体重持续增长,与阴性对照组无显著性差异。在结束观察后,对心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、脑进行了检测,结果表明各脏器无明显毒性反应,重量相较阴性对照组无显著性差异。当用1×106 cells或5×106 cells剂量的NSCs进行皮下给药后,在16周的致瘤性观察期内,小鼠无肿瘤产生,体重与阴性对照组无显著性差异。各主要脏器中均无肿瘤细胞生成,未见致瘤作用,表明NSCs用于移植治疗有较高的安全性。本课题将干细胞及其外泌体作为具有治疗功能的生物载体向缺血性脑卒中脑损伤部位靶向递送治疗基因,发挥神经修复效果。对NSCs非病毒基因转染体系进行研究,并对NSCs的外泌体进行膜表面性质改良和携载生物因子的调整,构建了增强生物载体携载治疗基因,提升治疗功能的方法。本研究通过考察移植治疗后的缺血性脑卒中模型动物的恢复情况,逐步揭示了 NSCs、BDNF基因转染的NSCs、EXOs以及H-EXOs在脑缺血损伤修复中的功能。本研究为基于干细胞/外泌体的生物类基因靶向传递系统的构建及其对缺血性脑卒中的治疗研究提供了理论与实验依据。