论文部分内容阅读
目的：急性白血病的发生、发展、治疗疗效及预后与异常的表观遗传学有关。其中，组蛋白甲基化修饰是表观遗传修饰的重要类型之一，JMJD3是组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)去甲基化酶，多种肿瘤JMJD3突变或表达下降，同时多种基因启动子区H3K27me3含量增多。本课题以去甲基化酶JMJD3为研究对象，检测急性白血病细胞组蛋白H3K27位点甲基化状态及JMJD3表达情况，干预DNA甲基化和组蛋白甲基化模式的平衡，探讨去甲基化酶JMJD3对急性白血病HL-60细胞生物学活性的影响，揭示急性白血病的表观遗传学发病机制，挖掘新的靶分子，为白血病诊断和基因靶向治疗提供新的思路。方法：（1）Western blot检测三种急性髓性白血病细胞HL-60、U937、NB4株中H3K27me3甲基化及去甲基化酶JMJD3的表达情况。（2）合成JMJD3寡核苷酸序列，将其连入Pegfp-C3质粒中，构建Pegfp-C3-JMJD3真核表达载体转染HL-60细胞，PCR、WESTERN BLOT检测质粒转染HL-60后JMD3及H3K27甲基化水平变化。（3）应用四唑盐（MTT）法绘制细胞生长曲线，观察Pegfp-C3-JMJD3对HL-60细胞增殖的影响；流式细胞仪分析细胞周期分布及细胞凋亡；Western blot检测Pegfp-C3-JMJD3转染HL60细胞后H3K27甲基化水平及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p15、p16表达水平的变化。结果：（1）在HL-60、U937、NB4三种急性白血病细胞组蛋白H3K27me3均高表达，同时去甲基化酶JMJD3表达减少。（2）Pegfp-C3-JMJD3转染48小时后，转染效率达75%±2.34%，与未转染组比较，转染组的JMJD3mRNA表达增加74.29%，H3K27me3蛋白表达量降低了78.54%。（3）Pegfp-C3-JMJD3转染组的细胞增殖率显著降低，48、72、96、120小时细胞的增殖率分别为（68.54±0.73）%，（49.10±2.31）%，（41.22±1.01）%，（40.68±2.45）%，明显低于阴性对照组和空白对照组（p<0.05）。Pegfp-C3-JMJD3质粒转染组G2/M比例明显增加，达到（46.02±0.92）%，高于空白对照组（18.56±3.71）%和阴性质粒对照组（22.86±1.45）%，p<0.05。空白对照组、阴性质粒对照组、转染组S期细胞分别为（33.54±1.41）%、（33.24±1.05）%、（10.94±1.78）%，转染组明显低于其他两个对照组（p<0.05）。比较阴性质粒对照组和空白组，转染组抑癌基因蛋白p15表达上调2.13倍、p16表达上调2.07倍。Pegfp-C3-JMJD3质粒转染组的48小时凋亡率分别为（56.1±1.08）%，而空白对照组和阴性对照组的凋亡率分别为（1.15±0.25）%和（1.96±0.63）%（p<0.05）。结论：（1）HL-60、U937、NB4三种急性白血病细胞组蛋白H3K27me3均高表达，同时去甲基化酶JMJD3低表达。（2）Pegfp-C3-JMJD3转染HL-60可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞于G2/M期，上调P15、P16分子的表达可能是其机制之一。