水稻抗褐飞虱基因Bph9的精细定位、育种应用及水稻ALOG结构域基因的生物信息学分析

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褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal,BPH),是世界范围内水稻(Oryza sativaL.)生产以及育种应用中危害性最严重的虫害之一。在实施绿色农业的大背景下,为了能够更有效地控制和防治褐飞虱的危害,最为关键的措施就是从水稻抗褐飞虱种质资源中不断发掘新的抗褐飞虱基因并将其转育到广泛播种的栽培稻品种中去,培育抗虫品种在水稻生产中应用。研究表明,斯里兰卡水稻农家种材料Pokkali对褐飞虱群体具有抗性,并携带一个抗褐飞虱显性基因Bph9。前人已将Bph9初步定位在水稻第12号染色体长臂两个SSR分子标记RM28486和RM28438之间的区段之中。我们在此基础上,利用Pokkali/93-11//93-11的BC3F2代以及高世代回交群体BC5F2代单株作为精细定位的群体,通过边缘标记进行重组单株的筛选,并对初步定位区间进行分子标记加密,将Bph9定位在分子标记InD2和Rsal之间68kb的区间内。随后在该定位区间确定两个候选基因。在精细定位的同时,我们通过抗性基因的分子标记辅助筛选以及全染色体多态性标记鉴定遗传背景替换率(回复率),分别构建了以籼稻93-11和粳稻日本晴为遗传背景的Bph9的近等基因系。结合水稻生长发育期和生殖发育期各阶段植株抗褐飞虱鉴定、,褐飞虱的存活率、宿主选择性实验、褐飞虱虫增重、蜜露分泌量等抗性效应分析及近等基因系对三种不同生物型褐飞虱的苗期抗性鉴定证明:来源于抗性亲本Pokkali的Bph9在93-11的遗传背景下确实能够显著地提高水稻植株的抗性水平。而在日本晴遗传背景下的Bph9近等基因系较抗性亲本Pokkali表现出明显降低的抗性。通过调查以93-11为遗传背景的近等基因系与水稻产量相关的农艺性状,如千粒重,穗长,穗数,实粒数等,我们发现其在这些核心性状上与轮回亲本93-11均无显著性差异,因此我们初步认为我们构建的NIL-Bph9可以投入水稻的实际生产育种中,我们申请了该品种的品种权,并将其重新命名为“珞扬9号”。以前的研究表明,抗性水稻品种Swarnalata携带的抗性基因Bph6位于水稻第4号染色体两个分子标记Y19和Y9之间所在的25kb的物理区段之中。我们通过将以93-11为遗传背景的Bph9近等基因系(BC7F2)和同样以93-11为遗传背景的Bph6近等基因系(BC5F2)(珞扬6号)配制杂交组合,在杂交的F2代单株中,我们分别通过分子标记H和InD2鉴定出包含Bph6和Bph9纯合位点的单株,实现了抗褐飞虱主效基因Bph9和Bph6在93-11遗传背景下的基因聚合。后续的抗虫鉴定和抗性效应分析表明:聚合材料对三种生物型褐飞虱都表现出极高的抗性水平,且其相对于单独含Bph9和Bph6的基因导入系(珞扬9号和珞扬6号)具有更强的抗性效应。通过宿主选择性实验鉴定褐飞虱的趋避性,褐飞虱田间群体对聚合材料表现出与单独含有Bph9和Bph6的近等基因系相比的显著性差异。聚合材料上褐飞虱的存活率在接虫后第9天开始明显比NIL-Bph9和NIL-Bph6下降。通过对聚合材料与轮回亲本93-11的产量相关农艺性状考察对比中,我们发现聚合材料在千粒重这个农业生产重要指标上要显著高于93-11,而其他农艺性状不存在显著性差异。我们同样申请了该聚合材料的品种权,并将其命名为“珞扬69”。珞扬69材料能够让我们在水稻实际生产以及育种方面对褐飞虱危害性的预防和防治增加一种可行性选择。由于单一的水稻抗褐飞虱基因介导的抗性可能在与褐飞虱协同进化的过程中逐渐丧失或者降低,而聚合材料的出现可能让Bph9和Bph6所介导的对褐飞虱的抗性更加持久。ALOG蛋白结构域因其最早被发现的拟南芥LSH1基因和水稻中的OsG1基因而被命名。在水稻仅有3个ALOG结构域基因被报道,文献表明它们均涉及到水稻花器官发育的调控。我们在此基础上,基于ALOG结构域基因家族的进化以及保守结构域分析,在7个代表性陆生植物物种中鉴定到了 84个ALOG结构域家族成员,其中在水稻中包含14个家族基因(4个为最新发现)。通过系统发生树的构建我们发现这一基因家族成员的扩增主要是在单双子叶植物分化以后开始的。在水稻中,我们将ALOG结构域基因简称为OsG1/G1L基因。我们发现基因的片段复制是形成OsG1/G1L基因的唯一动力。通过对华中农业大学CREP数据库下载的水稻生育期33个组织芯片表达谱进行分析,我们发现OsG1/G1L基因从水稻的营养生长到生殖生长呈现了一个多元化的表达模式。根据Cluster聚类分析,3个不同表达聚类中的成员基本表现出了一定的共表达模式,且这种共表达呈一定的组织特异性。根据基因转录谱和后续的定量PCR验证,我们推测了所有OsG1/G1L基因在水稻发育中的潜在功能。最后我们同样通过CREP上水稻33个组织芯片转录谱将OsG1/G1L与之前研究较为完善的调控水稻花器官发育的OsMADS亚家族进行时空共表达分析。所有的结果表明水稻中的OsG1/G1L基因中最先出现的可能是调控一些非花器官发育的基因,这部分基因的基因结构和蛋白质保守结构域和拟南芥中的ALOG结构域基因类似。它们也保持了 ALOG结构域基因在双子叶物种某些组织中的保守的表达模式,如种子和根。随后在水稻不断的进化过程中,出现了一些新的调控水稻花器官发育的基因,如穗和小穗发育以及穗分生组织时期调控的基因,还有一些基因涉及到脱落酸(ABA)诱导的植株生长发育以及水稻组成型防御过程。在该过程中,有的OsG1/G1L基因因其基因结构缺失或是蛋白质缺少某些行使功能的必要结构模体(motif)而变成了假基因,而有的基因因其在水稻全生长期表达,我们认为是管家基因。有趣的是OsG1/G1L基因在水稻花器官和非花器官的发育调控中大多是与OsMADS-box亚家族基因共同行使完成的。除此之外,对其他多个物种的系统发生和系统演化分析也为OsG1/G1L的直系同源基因在其他物种中的表达模式和潜在功能提供一定的线索。
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