论文部分内容阅读
本研究以农业废弃物着手,本着变废为宝和保护环境的宗旨,优化木质纤维素酶的固态共发酵工艺,改造木质纤维素酶的最适温度,志在解决二代生物乙醇的生产瓶颈。本研究为木质纤维素酶的高水平表达和二代生物乙醇高水平生产提供技术支撑,为木质纤维素酶最适温度的分子改造提供科学依据。具体研究内容和结果如下:1)以农业废弃物稻草和麸皮为原料,基于草酸青霉16（Po16）和里氏木霉Rut-C30的各自产酶优势,首次利用它们固态共发酵体系生产木质纤维素酶,采用单因素和响应曲面法优化生产工艺,使滤纸酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶（BGL）分别达到38.0IU/gds、352.9IU/gds、713.2IU/gds、15.7IU/gds、188.6IU/gds,与优化前相比,分别提高了4.2倍、2.9倍、2.03倍、1.08倍和1.96倍。2)利用上述1)获得的木质纤维素酶水解未处理麸皮（WB）、预处理稻草（pre-RS）,以及未处理麸皮和预处理稻草的混合物（WB+pre-RS）,利用不等温半同步糖化发酵方法生产二代生物乙醇。具体为,以20IU/gds（FPase/克干物质）和10%固体载物量的投放量于pH5、45℃和150rpm条件下进行48h糖化,WB的糖化效率达到94.26%,pre-RS达到42.04%,WB+pre-RS达到93.23%;糖化后加入酿酒酵母UV-20于35℃静置发酵48h,WB的乙醇转化效率高达98.41%,pre-RS达到67%,WB+pre-RS达到90.8%,WB乙醇转化效率明显高于pre-RS转化效率。3)BGL是木质纤维素水解的关键限速酶。Po16BGL能耐受任何浓度的木质素衍生物和呋喃衍生物,对乙醇、无机盐和有机酸盐也具有较好的耐受性,这表明它在生物乙醇生产中具有潜在的应用价值。抑制剂对Po16BGL的抑制程度为:水杨苷-有机酸>有机酸>水杨苷-有机酸钠盐>有机酸钠盐>水杨苷>水杨苷-KCl>水杨苷-NaCl>水杨苷-乙醇=乙醇。4)为缩短BGL最适温度与酿酒酵母最适发酵温度的差距,以Po16BGL为研究对象,采用易错PCR方法,构建pGAPZαA-bgl载体并整合到毕赤酵母GS115,根据96孔板的高通量筛选方法,以便获得最适温度降低且活性高的突变酶。与初始酶相比较,Y-1-B1突变酶的比活提高至1.8倍,最适温度从70℃降低为50℃,Kcat/Km达76.521 mL/mg.min,催化效率是初始酶的1.53倍。