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目的和意义结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤,居欧美圉家肿瘤死因第2～3位和我国肿瘤死因第3～4位。由于大部分患者确诊时往往已经处于进展期,手术切除局部瘤块结合化学治疗（chemotherapy）成为结肠癌最重要的治疗方式。5-氟尿嘧啶（5Fluorouracil,5-FU）和奥沙利铂（Oxaliplatin,L-OHP）是治疗进展期大肠癌最主要的两种一线化疗药物。循证研究资料显示,基于5-FU或L-OHP的化疗方案FOLFOX对结肠癌的疗效较佳,临床报告治疗反应率达45%～54%,中位生存期达19.5～20.6个月。尽管如此,进展期结肠癌患者治疗过程中出现对化疗药物的内源性或获得性耐药,是导致治疗失败的主要原因。因此,如何克服肿瘤对化疗药物的耐受已经成为结肠癌治疗面临的重要挑战。研究报道最多、较为公认的影响肿瘤化疗敏感性的指标主要包括胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase,TS）,胸苷酸磷酸化酶（Thymidinephosphorylase,TP）,谷胱甘肽—S—转移酶π（glutathione-S-transferase,GST-π）,P-糖蛋白（P-glycoprotein,Mdr-1/pgp）,多药耐药相关蛋白（Multi-drug resistance protein,MRP）等药物代谢相关蛋白（Drug metabolization associated protein）。肿瘤组织中上述蛋白表达增高后,通过影响化疗药物的代谢、加速药物失活或增加药物外泵等机制降低化疗药物细胞内浓度,降低化疗药物的细胞毒效应,从而介导肿瘤耐药。肿瘤干细胞（Tumor stem cell,TSC）是处于静止期（G0 srage）、具有自我更新（Self renewal）并定向分化为肿瘤细胞能力的一类细胞。肿瘤干细胞与肿瘤的发生、进展和远处转移密切相关。近年来有研究报道肿瘤干细胞通过高表达ABC转运蛋白家族参与肿瘤细胞多药耐药（Multidrugresistance,MDR）。因此肿瘤干细胞可能是结肠癌耐药的根源。本研究首先通过检测5种不同结肠癌细胞株中TS、TP、GST-π、pgp、MRP1等药物代谢相关基因的mRNA和蛋白表达水平的差异,结合5-FU、L-OHP的体外药敏实验,探讨TS、TP、OST-π、pgp、MRP1表达水平与5-FU、L-OHP化疗敏感的相关性,从中分析耐药细胞株中药物代谢相关基因表达谱,为临床开展耐药指标筛查指导结肠癌个体化化疗提供依据。同时,我们分别通过无血清培养基（Serum free medium,SFM）悬浮培养和免疫磁珠分选技术（Magnetic-activated cell sorting,MACS）从普通SW480细胞中获取结肠癌干细胞（colon cancer stem cell,CSC）,比较结肠癌干细胞及其亚群和普通SW480中耐药相关基因的表达水平差异,初步探索结肠癌干细胞的耐药机制,为进一步进行靶向杀伤结肠癌干细胞研究奠定基础。材料和方法1、主要材料:人结肠癌活检标本,人结肠癌细胞株SW1116、sw480、Lovo、HT-29、HCT116,鼠抗人TS单克隆抗体、鼠抗人TP单克隆抗体、鼠抗GST-π单克隆抗体,鼠抗人Mdr-1单克隆抗体,鼠抗人MRP1单克隆抗体,总RNA提取试剂盒,引物,5-FU,L-OHP;DMEM/F12培养基,表皮生长因子（EGF）,碱性成纤维生长因子（bFGF）,B27添加剂,CD44+干细胞免疫磁珠分离试剂盒,CD166+干细胞免疫磁珠分离试剂盒。2、方法:2.1免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）通过内镜活检钳取结肠腺癌组织标本,常规福尔马林固定,石蜡包埋、病理切片,经过烤片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后,根据不同抗体的要求进行相应抗原修复;PBS冲洗后滴加3%H2O2孵育10分钟阻断内源性过氧化物酶;再次PBS冲洗,滴加特异性小鼠抗人单克隆一抗,4℃孵育过夜;PBS冲洗后滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体,室温孵育30分钟;PBS冲洗后DAB染色30秒,苏木素复染,1%盐酸酒精分化、自来水冲洗返蓝,最后进行脱水、透明、封片。2.2细胞培养（cell culture）结肠腺癌细胞株SW1116、sw480、hovo、HT-29、HCT116由我科实验室常规保种,复苏后加入含10%胎牛血清RPMI1640培养液,接种至25cm2培养瓶中,放入5%CO2 37℃恒温培养箱培养。2.3免疫印迹分析（western blotting analysis,WB）RIPA裂解液加入贴壁培养细胞冰上裂解培养细胞30min,每5分钟使用超声粉碎仪粉碎一次,4℃20000g离心30min后取上清获取总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度,加入5XSDS蛋白上样缓冲液95℃变性5min。配胶后每孔上样50ug,SDS—PAGE凝胶电泳,根据目的蛋白分子大小不同使用2mA/cm2转膜。5%脱脂奶粉37℃封闭1h,加入稀释好的小鼠抗人一抗TS（1:300）,PD-ECGF（1:400）,GST-P1（1:500）,Pgp（1:200）,MRP1（1:200）4℃孵育过夜。TBST洗膜5分钟×3次后加入山羊抗小鼠二抗（1:3000）37℃孵育1h。洗膜后加入ECL发光试剂盒发光,曝光、显影、定影后进行摄影,图象分析。2.4免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）细胞贴壁生长于盖玻片,使用4%多聚甲醛进行固定,0.2%Triton/0.01MPBS透膜后采用Maxvision二步法免疫组化检测系统进行染色。2.5 WST-8分光光度法（WST-8 colorimetric assay,CCK8）体外药敏实验抗肿瘤药物氟尿嘧啶、奥沙利铂梯度稀释溶解于RPMI1640培养基,加入到96孔板贴壁培养4h的SW1116、SW480、LOVO、HT-29、HCT116细胞中孵育作用48小时,加入WST-8（2-（2-methoxy-4-nitrophenyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2,4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium,monosodium salt）溶液处理1小时,采用酶标仪检测不同药物浓度处理的细胞在450nm波长的光密度(OD450)。不同药物浓度处理细胞的OD450与对照处理细胞OD450比值即为化疗药物对肿瘤细胞的抑制率（inhihition rate）,根据不同浓度药物的抑制率作出抑制曲线,计算5-FU和L-OHP对5株结肠癌细胞株的半数抑制浓度（50%inhibition concentration,IC50）。2.6无血清培养（serum free medium,SFM）结肠癌干细胞将SW480重悬至含20ng/mlEGF,10ng/mlbFGF,10ng/mlLIF,B27（1:50）和2mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基（serum-free medium,SFM）,接种于超低贴壁培养瓶（ultra low attachment flask）,放入5%CO2 37℃恒温培养箱培养进行悬浮培养。待SW480形成典型干细胞球（Tumor sphere cells）后,收集结肠癌干细胞。2.7免疫磁珠分选（Magnetic-activated cell sorting,MACS）贴壁培养SW480加入0.25%胰酶消化,收集约108细胞重悬于含22.4g/L葡萄糖、0.5%BSA的0.01MPBS缓冲液中,按CD44、CD166干细胞分离试剂盒说明书依次加入人Ig、半抗原耦联的抗CD44、CD166单克隆抗体、抗半抗原结合的免疫磁珠进行孵育标记,然后将细胞缓慢通过固定于磁场的分离柱收集CD44或CD166阳性细胞,洗脱的即为CD44、CD166阴性细胞。结肠癌干细胞CD44+、CD166+亚群。2.8 Real time PCR定量扩增采用总RNA提取试剂盒（TRIZOL reagent）分别提取结肠癌细胞株、结肠癌干细胞以及结肠癌干细胞CD44+、CD166+亚群总RNA,进行逆转录反应（reverse transcription,RT）获取目的基因的cDNA,同时对不同细胞药物代谢相关基因进行定量PCR扩增,比较不同细胞株中药物代谢基因的表达差异。2.9统计学处理应用SPSS13.0软件,不同细胞株之间药物代谢相关基因mRNA表达水平、化疗药物IC50的不同采用单向方差分析（One-way ANOVA）进行比较。5-FU和L-OHP的IC50与药物代谢相关基因mRNA表达水平相关性分析采用spearman双变量相关分析。SW480和CSCs、CD44+SW480和CD44-SW480、CD166-SW480和CD166+SW480中药物代谢相关基因mRNA表达差异均采用独立样本t检验（Independent samples T-test）比较。P＜0.05具有显著统计意义。结果1、免疫组化检测结果显示,TS,TP,GST-π,Pgp,MRP1等药物代谢相关蛋白在结肠癌组织中普遍表达。2、Western blotting和免疫细胞化学均显示TS,TP,GST-π,Pgp,MRP1蛋白表达水平在HT-29细胞株中表达强度最高,而LOVO细胞株只有TS表达。预示HT-29为高度耐药细胞株,而LOVO对化疗药物可能相对敏感。3、TS mRNA在结肠癌细胞株中的表达从高到低依次为SW1116,HT-29,LOVO,SW480,HCT116;TP依次为SW1116,HT-29,HCT116,LOVO,SW480;GST-π依次为LOVO,HT-29,SW480,HCT116,SW1116;Pgp依次为HT-29,SW1116,LOVO,SW480,HCT116;MRP1依次为HCT116,SW480,HT-29,LOVO,SW1116。4、体外药敏证实,HT-29细胞对5-FU,L-OHP均耐药,LOVO、SW480分别对5-FU、L-OHP较敏感。5、5-FU的疗效与结肠癌细胞中TP、Pgp、TS的表达呈负相关,而L-OHP疗效与GST-π、Pgp、TP的表达呈负相关。MRP1的表达与5-FU、L-OHP疗效无明显相关关系。6、通过无血清悬浮培养方法,成功地将SW480诱导形成典型形态的结肠癌干细胞球。进行real timePCR检测药物代谢基因的表达水平,结果发现CSCs中MRP1表达水平显著高于普通SW480,而TS的表达水平相对较低。7、采用免疫磁珠法分选SW480获取结肠癌干细胞CD44+亚群、CD166+亚群,real timePCR检测药物代谢基因mRNA表达,证实TP在CD44+亚群中表达水平显著高于CD44-亚群;CD166+亚群中药物代谢基因表达差异无统计学意义。结论1、结肠癌中药物代谢相关蛋白TS,TP,GST-π,Pgp,MRP1表达普遍,体外药敏实验证实结肠癌中TS、TP、Pgp的表达水平与5-FU的化疗敏感性呈负相关,而GST-π、PgP、TP的表达水平则与L-OHP化疗敏感性呈负相关。因此,在结肠癌化疗前采用Real time PCR或免疫组化检测肿瘤组织中药物代谢相关蛋白表达水平,对于临床医生选择相对敏感的化疗方案,对结肠癌患者进行个体化治疗具有重要的指导作用。2、结肠癌干细胞及CD44+亚群中不同程度高表达MRP1、TP,提示结肠癌干细胞逃避化疗药物杀伤可能是结肠癌患者化疗失败,导致肿瘤进展的根本原因。进一步研究针对结肠癌干细胞的靶向杀伤药物,对于提高结肠癌治疗反应率,改善患者预后具有里程碑式的意义。