目前，微生物引起的食品安全问题受到世界各国的关注。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）被认为是三种重要的污染食品的致病菌，由这些菌引起的食物中毒事件近年来呈上升趋势。通常，对这三种菌的传统的检测和鉴定方法依赖于分离培养和生化鉴定等，但这些方法烦琐费时、耗力，且特异性不强。因此，建立快速、灵敏、特异性强的病原微生物检测方法是食品安全的当务之急。 近年来免疫学和分子生物学的发展，为食源性致病菌的检测提供了良好的技术平台。本文综述了免疫荧光抗体技术、酶联免疫技术、免疫金技术、核酸探针、多重PCR、基因芯片、生物传感器等方法，其中多重PCR因其具有高效性、特异性和简便性，因而被选择作为本研究的主要研究方法。 本研究内容分两部分，第一部分侧重于三种食源性致病菌的多重PCR检测。根据副溶血弧菌的耐热直接溶血素基因（tdh）、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）和单核细胞增生李斯特菌的侵入关联蛋白基因（iap）分别设计引物，经验证表明三对引物的特异性良好，引物间不存在交叉。以三种菌的混合DNA为模板，使用每对引物进行单重PCR扩增，分别得到了相关的目的基因片段，经克隆和序列分析，tdh、nuc和iap基因与GenBank中相关序列的同源性分别达到100％、100％和98％。在单重PCR条件的基础上，建立了对三种菌的多重PCR检测方法，并对Mg2+浓度、dNTP浓度和延伸时间等反应体系和反应条件进行优化。结果表明：三对引物能特异性地扩增出202bp、484bp和714bp的目的片段。优化后的多重PCR反应体系为：10×PCR buffer（-Mg2+）2．5μL、200μmol/L dNTP、2mmol/L Mg2+、模板2μL、2．5U Taq酶，引物浓度分别为：副溶血弧菌200nmol/L、金黄色葡萄球菌40nmol/L、单核细胞增生李斯特菌320nmol/L，总反应液25μL。反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、58℃退火40s、72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸15min。为检验该方法的实用性，对人工污染的贝类模拟样品进行了单重PCR和多重PCR检测，结果显示：单重PCR检测限为：副溶血弧菌2．3CFU/mL、金黄色葡萄球菌2．5CFU/mL、单细胞增生李斯特氏菌1．5 CFU/mL；多重PCR的检测限为副溶血弧菌2．3×102CFU/mL、金黄色葡萄球菌2．5×101CFU/mL、单核细胞增生李斯特菌1．5×103CFU/mL。本研究通过多重PCR技术实现了对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的一次性检出，具有快速，灵敏度高，特异性强等优点。 第二部分内容为副溶血弧菌耐热直接溶血素基因tdh的原核表达研究。通过PCR技术扩增得到tdh全长基因，将其连接克隆载体pMD18-T后进行测序分析，证实无点突变，且两端成功引入限制性酶切位点。将表达载体pET-32a与tdh用EcoRⅠ和HindⅢ分别进行双酶切后连接，经阳性克隆鉴定，成功构建了tdh的原核表达载体pET32a-tdh。为TDH蛋白的获得及抗体的制备奠定了基础。