研究背景:卵巢癌是一种严重威胁全球女性生命健康的常见恶性肿瘤,目前卵巢癌的主要治疗方法包括外科手术治疗和以铂药为核心的化学药物治疗,而长期应用化疗药物引起的耐药严重限制了其治疗效果。因此,迫切需要研究卵巢癌细胞对铂类药物的耐药机制,寻找提高卵巢癌细胞对化疗药物敏感性的有效方法。已有研究发现,顺铂可以通过靶向损伤肿瘤细胞线粒体功能产生细胞杀伤作用。但当应用顺铂时,肿瘤细胞将产生一系列线粒体质量控制来抵抗顺铂的细胞毒性。最近,越来越多的证据表明,Bcl-2家族与线粒体功能调控密切相关,其参与调控线粒体自噬、细胞凋亡以及线粒体分裂与融合的动态过程,是线粒体质量控制的关键因子。在细胞凋亡过程中,通过抑制Bcl-2家族抗凋亡蛋白介导的线粒体融合,Bcl-2家族促凋亡蛋白BAX和BAK过表达可促进线粒体分裂。然而,Bcl-2家族蛋白质如何在分子水平上影响线粒体动力学的机制尚不明确。Bcl-2家族蛋白可通过许多通路调控线粒体质量,其中包括参与调节线粒体功能的SIRT3蛋白通路。SIRT3是NAD~+依赖性组蛋白去乙酰化酶家族的成员之一,近年来因其在肿瘤遗传学、衰老、神经退行性疾病中的作用备受关注,在生理状态下SIRT3定位于细胞核与线粒体,当细胞处于应激状态或当SIRT3表达增加时,SIRT3会从细胞核转移至线粒体。并且据文献报道,SIRT3在沉默Bcl-2介导的细胞凋亡过程中不可或缺,换言之SIRT3是Bcl-2调控细胞凋亡的重要介质。鉴于SIRT3和Bcl-2家族蛋白在调节线粒体功能中发挥重要的调节作用,我们尝试探讨SIRT3是否参与调节与Bcl-2家族蛋白功能相关的线粒体功能障碍。实验目的:卵巢癌预后不良主要是由化疗耐药引起的。越来越多的研究表明,Bcl-2家族蛋白与肿瘤及线粒体动力学的分裂/融合调控之间存在一定关系,且参与肿瘤的耐药机制。然而,Bcl-2家组蛋白通过调节卵巢癌细胞的线粒体功能增加对顺铂敏感性的具体机制仍不清楚。SIRT3作为组蛋白脱乙酰酶,参与肿瘤中线粒体功能的调节,沉默而Bcl-2家族蛋白诱导的凋亡需要SIRT3的参与。在本研究中,我们旨在探讨SIRT3与ABT737和顺铂在卵巢癌细胞中诱导的线粒体功能障碍之间的机制联系。实验方法:Annexin V/PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡。使用SIRT3脱乙酰酶荧光测定法评估SIRT3活性。在JC-1染色后通过流式细胞术检查线粒体膜电位。通过蛋白质印迹分析证实SIRT3的过表达和敲低以及细胞凋亡。通过免疫荧光染色或蛋白质印迹分析检测线粒体裂变/融合动力学。实验结果:确定了Bcl-2抑制剂ABT737可以通过调控Bcl-2家族蛋白表达水平,导致线粒体膜电势去极化,最终导致卵巢癌细胞线粒体途径凋亡;SIRT3的过度激活通过线粒体途径促进SKOV3细胞凋亡,特异性敲减SIRT3可部分逆转顺铂联合ABT737对线粒体膜电势的影响,SIRT3是ABT737增强SKOV3卵巢癌细胞顺铂敏感性的关键分子,并且SIRT3的表达量与活性均对该过程有影响;顺铂联合ABT737对线粒体融合无明显作用,ABT737联合顺铂促进了DRP1从胞浆转位进入线粒体,从而导致线粒体的分裂。SIRT3的激活增加了线粒体中DRP1的定位,而胞浆中DRP1的定位减少了,提示SIRT3的激活使DRP1由胞浆转位进入线粒体,进而可能促进线粒体的分裂。实验结论:应用Bcl-2的小分子抑制剂ABT737联合顺铂,SIRT3的表达上调并且活性升高,可能促进了SKOV3卵巢癌细胞的线粒体分裂,最终导致线粒体途径凋亡,从而提高其对顺铂的敏感性,为逆转肿瘤细胞顺铂耐药提供新的方法和思路。