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目的通过建立大鼠酒精性肝损伤模型,观察纳豆激酶(Nattokinase)对大鼠酒精性肝损伤(Alcoholic liver injury,ALD)的改善作用,并初步探讨其改善作用机制。方法1.动物分组及模型建立:SPF级雄性Wistar大鼠60只,适应性喂养1周后,按体重随机分为5组:正常对照组、纳豆激酶对照组、模型组、纳豆激酶干预组、甘利欣干预组。给药方法如下:正常对照组给予生理盐水灌胃;纳豆激酶对照组给予530FU/(kg·bw·d)纳豆激酶灌胃,模型组给予56°红星二锅头灌胃,剂量依次为6ml/(kg·bw·d)1周,8ml/(kg·bw·d)1周,10ml/(kg·bw·d)1周,11 ml/(kg·bw·d)7周;纳豆激酶干预组给予530FU/(kg·bw·d)纳豆激酶和酒精灌胃;甘利欣干预组给予200mg/(kg·bw·d)甘利欣(保肝药)和酒精灌胃。后两组的酒精剂量与模型组相同,实验周期为10周。末次灌胃后禁食不禁水12h,戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,留取肝脏HE标本和电镜标本,剩余肝组织液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。2.光镜观察大鼠肝脏组织病理学改变,并对肝脏进行组织病理学评分。透射电镜观察大鼠肝脏组织超微结构变化。3.全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(Glutamic pyruvic transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase,AST)、谷氨酰转肽酶(Glutamyl transpeptidase,GGT)、胆碱酯酶(Cholinesterase,CHE)活性。酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠血清内毒素表达水平。4.流式细胞术检测各组大鼠外周血中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群和自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK)占淋巴细胞比例,并计算CD4~+T细胞/CD8~+T细胞比值。5.蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测各组大鼠肝组织中Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)、CD14和肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)蛋白表达水平。结果1.光镜观察结果显示,正常对照组和纳豆激酶对照组大鼠肝小叶结构清晰,肝细胞完整充盈,排列整齐;模型组大鼠肝小叶结构模糊,肝索排列紊乱,出现脂肪变性和胞浆空泡,并有大量炎性细胞浸润,与正常对照组相比,病理学评分明显升高(P<0.05);纳豆激酶干预组和甘利欣干预组,上述病变得到明显改善,病理学评分显著下降(P<0.05),且纳豆激酶干预组肝组织病理改善程度低于甘利欣干预组。2.透射电镜结果显示,正常对照组和纳豆激酶对照组大鼠肝组织结构无异常改变;模型组肝细胞核出现变形、萎缩,粗面内质网扩张断裂,核糖体脱落,线粒体数量减少;纳豆激酶干预组上述病变得到明显改善,其改善效果低于甘利欣干预组。3.血清生化指标结果显示,与正常对照组相比,纳豆激酶对照组无明显变化,模型组大鼠血清ALT、AST、GGT水平显著上升(P<0.05),CHE显著下降(P<0.05);与模型组相比,纳豆激酶干预组和甘利欣干预组大鼠血清ALT、AST、GGT水平均显著下降(P<0.05),CHE有不同程度上升趋势;且纳豆激酶干预组与甘利欣干预组比较各指标差异无统计学意义。4.血清内毒素指标结果显示,与正常对照组相比,纳豆激酶对照组无明显变化,模型组大鼠血清内毒素水平显著上升(P<0.05);与模型组相比,纳豆激酶干预组和甘利欣干预组大鼠血清内毒素水平显著下降(P<0.05);且纳豆激酶干预组与甘利欣干预组比较差异无统计学意义。5.流式细胞术结果显示,与正常对照组相比,纳豆激酶对照组各指标无明显变化,模型组大鼠外周血D3~+CD4~+T细胞百分比、D3~+CD8~+T细胞百分比、TCRαβ~+CD161~+NK细胞百分比均明显下降(P<0.05),CD3~+CD4~+/CD3~+CD8~+T细胞比值明显升高(P<0.05);与模型组相比,纳豆激酶干预组和甘利欣干预组CD3~+CD4~+T细胞百分比和CD3~+CD8~+T细胞百分比显著升高(P<0.05),TCRαβ~+CD161~+NK细胞百分比有不同程度的上升趋势,CD3~+CD4~+/CD3~+CD8~+T细胞比值明显下降(P<0.05),且纳豆激酶干预组与甘利欣干预组比较各指标无显著性差异。6.Western blot结果显示,与正常对照组相比,纳豆激酶对照组各指标无明显变化,模型组大鼠肝组织TLR4、CD14和TNF-α蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,纳豆激酶干预组大鼠肝组织TLR4蛋白表达水平显著下降(P<0.05),CD14和TNF-α蛋白表达水平有一定下降趋势;甘利欣干预组大鼠肝组织TLR4和TNF-α蛋白表达水平显著下降(P<0.05),CD14蛋白表达水平有一定下降趋势;纳豆激酶干预组与甘利欣干预组比较各指标无显著性差异。结论1.一定量酒精摄入会引起大鼠肝脏损伤。2.适量补充纳豆激酶在一定程度上可以改善酒精性肝损伤。其机制可能与纳豆激酶调节外周血CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、NK细胞等免疫细胞比例,抑制酒精引起的大鼠血清内毒素和肝组织TLR4、CD14、TNF-α表达上调有关。