肺癌是我国最为常见的肿瘤之一,近年来的发病率和死亡率都有增长的趋势,严重威胁人类的健康。尽管近年来在肺癌的治疗上取得突破性的进展,但是治疗后的耐药、复发、转移等诸多问题仍然是肺癌患者长期生存的巨大的隐患。肺癌的发病发展机制中仍有许多不解之谜。这些谜底的不断揭示,将为肺癌的个体化治疗提供更多新的靶点。许多研究表明Hedgehog在胚胎发育时期具有重要作用的信号通路在恶性肿瘤的发生发展过程中也扮演举足轻重的作用,如Wnt、 Norch、TGF及hedghoge等信号通路。多项研究对Hedgehog信号通路在肿瘤作用的研究显示,这条Hedgehog(?)言号通路是调控胚胎发育的重要信号通路在包括人类皮肤基底细胞癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌以及小细胞肺癌等在内的多种肿瘤的发生发展过程中都有异常激活。hedgehog (Hh)信号通路作为生物进化史上最为保守的信号途径之一,控制了脊椎动物和非脊椎动物众多发育过程中细胞的生长、分化及增殖。Hh信号通路的异常将会导致包括出生缺陷、癌症及肥胖在内的多种异常发育和生理性疾病。Hh是一种分泌蛋白。Hh信号通路包含Patched (Ptc)、Smoothened(Smo)及通路下游的Costal2(Cos2)、 Fused(Fu)、Suppressor of fused (Su(fu))、Cubitus interruptus (Ci)等多种蛋白。在脊椎动物中Hedgehog信号通路有三个配体sonichedgehog (SHH),Deserthedgehog(DHH),Indianhedgehog(IHH),两个跨膜受体petehed(PTCH)、Smothen(SMO),三个转录因子CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3(GL11、GLIZ、GLI3)及下游的靶基因等组成。目前,对Hedgehog(?)f言号在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)(?)中的作用机制尚不清楚,尽管已经有几项对Hh通路激活途径在NSCLC中作用的研究,但对于hedgehog通路抑制基因在NSCLC中的甲基化的研究仍然未知。目的：探索Hedgehog通路抑制基因SHH、DHH、IHH、SMO及PTCH蛋白在非小细胞肺癌组织的甲基化表达情况以及其潜在的临床意义。系统研究hedgehog通路抑制基因与下游转录因子PTCH蛋白表达的相关性,为进一步阐明肺癌发生发展过程中的分子机制,以寻找肺癌诊断及治疗新靶点提供理论依据。方法：收集广西壮族自治区广西医科大学第一附属医院心血管研究所胸心外科2010年11月至2012年12月存档的NSCLC切除组织石蜡标本共108例,用甲基化特异性PCR(MSP, Methylation specifie polymerase chain reaction)方法检测临床上经病理确诊断为NSCLC重新构建组织芯片。所有患者术前均未进行放疗、化疗以及其它抗肿瘤治疗,临床病理资料完整。应用MSP方法检测肺癌组织中SHH、IHH、DHH、SMO及PTCH蛋白甲基化的表达情况,根据肿瘤组织细胞的甲基化程度进行判定Hedgehog通路抑制基因作用。应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行分析；各分子表达结果与临床病理参数的检验采用卡方检验分析,理论频数有小于5者应采用Fisher确切概率法分析;等级资料应采用两个独立样本的Mann-whitneyU检验;单变量生存分析应采用KaPlan-Meier法,各亚组间差异比较用Logrank分析；多变量分析应采用coX回归；Hh的相关性使用偏相关分析；配对的肺癌组织与癌旁正常组织之间甲基化的表达差异用配对样本的Wilcoxon秩和检验；以a=0.05(双侧)为检验水准,p<0.05为有统计学意义。结果：1.SHH的甲基化同高分化肺癌相关SHH的甲基化主要在NSCLC组织的肿瘤细胞中表达,亚细胞定位在细胞浆。SHH可评估组织共有108个,其中SHH高表达者占87.2%(94/108),低表达者占12.8%(14/108)；SHH的甲基化表达水平与年龄、性别、病理类型、TNM分期、T分期、远处转移及淋巴结转移等临床病理参数均无关,但与分化程度相关,SHH的甲基化表达越高则分化程度越高(非参数检验Mann-Whitneyutest, p=0.044)。进一步分析病理亚型分层显示,在肺腺癌中SHH的甲基化表达水平与各临床病理参数均无关。但是在肺鳞癌中SHH的甲基化表达与分化程度相关,SHH的甲基化表达越高则分化程度越高(非参数检验Mann-Whitney U test, p=0.005)。2.DHH的甲基化同临床病理参数无关DHH的甲基化主要在NSCLC组织的肿瘤细胞中表达,亚细胞定位于细胞浆。DHH的甲基化可评估组织共有95个,其中高表达者占81.3%(77/95),低表达者占18.7%(18/95)；DHH的甲基化表达水平与性别、年龄、病理类型、T分期、TNM分期、远处转移、淋巴结转移及分化程度等临床病理参数均无关。进一步分析病理亚型分层显示在肺腺癌及鳞癌中DHH的甲基化表达与各临床病理参数均无关。3.间质IHH的甲基化同分期相关IHH的甲基化在NSCLC组织的肿瘤细胞和间质细胞均有表达,亚细胞定位于细胞膜和细胞浆。肿瘤细胞IHH的甲基化可评估组织共有108个,高表达者占51.9%(56/108),低表达者占48,1%(52/108)；间质细胞IHH的甲基化可评估组织共有102个,高表达者占76.7%(78/102),低表达者占23.3%(76/102)；上皮IHH的甲基化表达与年龄、性别、病理类型、TNM分期、T分期、远处转移及分化程度等临床病理参数均无关；但间质IHH的甲基化表达与年龄(卡方检验,P=0.046)、TNM分期(卡方检验,P=0.036)及T分期均有关(卡方检验,P=0.020),年龄越大、TNM分期及T分期越晚则间质IHH的甲基化表达越高。进一步的病理亚型分层分析显示在肺腺癌和鳞癌中肿瘤细胞IHH的甲基化表达水平与年龄、性别、TNM分、T分期、远处转移及分化程度等临床病理参数均无关；但在肺腺癌中间质IHH的甲基化表达与年龄有关,年龄越大则间质细胞IHH的甲基化表达水平越高(卡方检验,P=0.021)。在肺鳞癌中间质IHH的甲基化表达与T分期有关,T分期越晚则间质细胞IHH的甲基化表达水平越高(卡方检验,P=0.011)。4.SMO的甲基化同高分化肺鳞癌相关SMO的甲基化主要在NSCLC组织的肿瘤细胞中表达,亚细胞定位于细胞膜和细胞浆。SMO的甲基化可评估组织共有107个,其中高表达者占87.2%(93/107),低表达者占12.8%(14/107)；SMO的甲基化表达水平与年龄、性别、病理类型、TNM分期、远处转移、淋巴结转移等临床病理参数均无关；但与分化程度有关,SMO的甲基化表达越高则分化程度越高(非参数检验Mann-Whitneyutest, P=0.049)。进一步分析病理亚型分层显示在肺腺癌中SMO的甲基化表达水平与年龄、性别、TNM分期、远处转移、淋巴结转移及病理分级等临床病理参数均无关。但是在肺鳞癌中SMO的甲基化表达与分化程度有关,SMO的甲基化表达水平越高则分化程度越高(非参数检验Mann-WllitneyUtest, P=0.034)。5. PTCH的甲基化在癌组织中表达显著高于正常组织为进一步探讨跨膜受体PTCH的甲基化在癌组织及癌旁组织中表达是否有差异,我们用20对肺癌及癌旁正常肺组织中PTCH的甲基化表达水平的原始评分行配对样本的Wilcoxon检验分析。秩号的符号由“癌组织表达水平-癌旁正常组织表达水平”决定,负秩号(NegativeRanks)有4例；正秩号(PositiveRa吐s)有13例；持平(TieS)有3例。负秩号的平均秩次为3.00,正秩号的平均秩次为7.73,以正秩号占优势,说明PTCH的甲基化在癌组织中表达明显高于正常组织,两者表达差异有统计学意义(配对秩和检验,P=0.005)。6. PTCH的甲基化低表达组的中位数总生存期显著高于高表达组单变量生存分析显示SHH、DHH及SMO的甲基化表达水平与NSCLC患者的生存无关,进一步的病理亚型分层分析未显示与肺腺癌和鳞癌患者的生存有关。但PTCH的甲基化表达水平与生存相关,PTCH的甲基化低表达组的中位数总生存为37个月,高表达组的中位数总生存为27.9个月,两者比较生存期差异有统计学意义(Log-ranktest, p=0.021)。因为PTCH的甲基化为核转录因子,因此我们单独分析了PTCH的甲基化在细胞核中的表达水平与生存的关系,结果显示PTCH的甲基化细胞核低表达组的中位总生存为33.9个月,高表达组的中为总生存为28.4个月,两者比较生存期差异有统计学意义(Log-ranktest, p=0.049)。进一步在肺腺癌和鳞癌这两种最常见的NSCLC病理亚型中进行生存分析研究,发现这种甲基化的表达对预后的影响主要表现在肺腺癌中。在腺癌中,总体上生存时间为33.9个月,生存为33.9个月,高表达组的中为总生存时间为28.4个月,两者比较生存期差异有统计学意义(Log-ranktest, p=0.049)。进一步在肺腺癌和鳞癌这两种最常见的NSCLC病理亚型中进行生存分析,发现这种表达对预后的影响主要表现在肺腺癌中。在腺癌中,总体上PTCH的甲基化低表达组的中位数总生存为41.7个月,PTCH的甲基化高表达组的中位数总生存时间仅为25.6个月,二者差异有显著性意义(Log一ranktest, P=0.013)。细胞核中PTCH的甲基化低表达组中位数总生存时间为40.8个月,PTCH的甲基化高表达组的中位数总生存时间为26.2个月,细胞核中PTCH的甲基化高表达的肺腺癌患者及其预后明显较低表达腺癌患者差,二者差异有显著性意义(Log-ranktest, P=0.016)。此外,在腺癌中间质IHH的甲基化表达水平与生存时间也有关；间质IHH的甲基化低表达组的中位数总生存时间为50.8个月,而其高表达组的中位数总生存时间仅为27.9个月,间质IHH的甲基化高表达患者的预后明显较低表达者差,二者差异有显著性意义(Log-ranLktest,介0.021)。在肺鳞癌中各分子的甲基化表达与生存均无关。进一步行COX回归分析,纳入变量有性别、年龄、分化程度、远处转移、淋巴结转移、T分期、IHH的甲基化表达水平及PTCH的甲基化表达水平,结果显示细胞核的PTCH的甲基化表达水平是肺腺癌患者预后的独立影响因素(HR=1.640,95%C1=1.1002.443,P=0.015)。结论：1. Hedgehog通路抑制基因中SHH、DHH、IHH、SMO及PTCH的甲基化在非小细胞肺癌组织中均有广泛表达。2. PTCH的甲基化在NSCLC组织中的表达水平明显高于正常组织,并且表达水平与淋巴结转移有关,因此PTCH的甲基化过表达对肺癌的发生发展可能起到促进作用。3.在腺癌中PTCH的甲基化及间质IHH的甲基化高表达者的预后显著较低表达者差,且细胞核的PTCH的甲基化表达水平可作为肺腺癌预后的独立预测因子。4.HH-PTCH通路抑制基因在肺腺癌和鳞癌中可能有不同的作用机制。在腺癌中可能通过旁分泌的作用调控PTCH活性,而在鳞癌中则可能是通过自分泌方式调控通路活性。