口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcimoma，OSCC)约占全身恶性肿瘤的2-3％，在全身主要的恶性肿瘤中排列第八位，是头颈部最常见的恶性肿瘤。舌鳞状细胞癌(Tongue squamous cell carcimoma，TSCC)则是最常见的口腔癌。目前对舌鳞状细胞癌主要采用外科手术为主，辅以化疗、放疗等多种治疗方法相结合的综合治疗模式，其5年总体生存率约为65％左右；导致治疗失败的主要原因则是肿瘤局部复发和远处转移。同时舌鳞状细胞癌的手术治疗会造成患者语言、咀嚼和吞咽功能的障碍，对患者的生活质量造成严重影响。另一方面，临床医生希望能够找到与舌鳞癌局部侵袭和远处转移密切相关，并且能够准确客观判断舌鳞癌患者的预后的生物学指标，制定合理的个性化的治疗方案，以提高舌鳞癌患者的治愈率和生存率。　　 本研究通过检测EMMPRIN在舌鳞癌组织中的表达情况，探讨EMMPRIN表达与舌鳞癌临床病理特征和患者生存期的相关性，明确EMMPRIN在舌鳞癌中的表达意义。同时以EMMPRIN基因为靶点，分别选择高表达EMMPRIN基因的舌鳞癌Tca8113细胞株和低表达EMMPRIN基因的舌鳞癌SCC-25细胞株为研究对象，利用RNA干扰技术沉默Tca8113细胞的EMMPRIN基因表达，检测Tca8113细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化及其下游产物MMP-2、MMP-9的分泌和活化情况；同时构建EMMPRIN慢病毒表达载体，并转染SCC-25细胞，检测SCC-25细胞的粘附和侵袭能力的变化及其下游产物MMP-2和uPA的生成和活化情况，明确EMMPRIN表达与舌鳞癌细胞侵袭能力的变化的相关性；进而探讨EMMPRIN在舌鳞癌侵袭中的作用机制，提供EMMPRIN为靶点的基因治疗的理论基础和实验依据，为口腔癌的治疗开辟新的途径。　　 第一部分舌鳞癌组织和细胞系中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达和意义　　 研究目的：　　 检测舌鳞癌组织和癌旁组织中EMMPRIN的表达，明确舌鳞癌中EMMPRIN表达及其与舌鳞癌患者临床病理特征和生存期之间的相关性，初步探讨EMMPRIN在舌鳞癌组织中的表达和临床意义。检测舌鳞癌细胞系Tca8113、SCC-25和Tscca中EMMPRIN的表达，为后续实验打下基础。　　 材料和方法：　　 选取1996年1月到2006年12月，中山大学附属第二医院口腔颌面外科确诊的68例舌鳞状细胞癌患者的舌鳞癌和癌旁非肿瘤性上皮病理组织标本。根据UICC-TMN2002年标准，对所有舌鳞癌患者的临床和病理资料进行统计分析。68例患者均进行完整随访，随访时间1～119个月，平均随访时间为27.5个月。采用SP免疫组织化学法检测68例舌鳞状细胞癌患者的舌鳞癌和癌旁非肿瘤性上皮组织中EMMPRIN的表达情况。对该组病例生存分析采用Kaplan-Meier法；预后分析采用Cox模型。采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。Western blot检测舌鳞癌细胞系Tca8113、SCC-25和Tscca EMMPRIN的表达。　　 结论：　　 舌鳞癌组织中EMMPRIN的表达高于相应的癌旁非肿瘤性上皮组织。舌鳞癌组织中EMMPRIN的表达与肿瘤大小和临床分期密切相关。EMMPRIN表达水平是本组舌鳞癌患者预后的独立预测因素。舌鳞癌Tca8113细胞中EMMPRIN呈高表达，SCC-25细胞中EMMPRIN呈低表达。　　 第二部分 EMMPRIN基因干扰抑制舌鳞癌Tca8113细胞增殖、凋亡和侵袭的实验研究　　 研究目的：　　 利用RNAi技术，观察EMMPRIN-siRNA干扰片段转染舌鳞癌Tca8113细胞对EMMPRIN基因表达、细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响，明确Tca8113细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化和EMMPRIN表达的相关性。在此基础上，利用明胶酶谱实验检测MMP-2和MMP-9的分泌和活化情况，探讨EMMPRIN表达对Tca8113细胞侵袭能力影响的机制。　　 材料和方法：　　 舌鳞癌Tca8113细胞在37℃、5％(v/v)CO2、饱和湿度的条件下，在含10％的FBS、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM培养液中培养。EMMPRIN-siRNA干扰片段由上海吉玛制药技术有限公司完成的设计和合成。采用RT-PCR检测EMMPRIN mRNA的表达，GAPDH作为内参。采用Western blot检测EMMPRIN的表达，Tubulin作为内参。MTT实验检测EMMPRIN-siRNA干扰片段转染抑制EMMPRIN表达对Tca8113细胞增殖的影响。流式细胞仪检测EMMPRIN-siRNA干扰片段转染抑制EMMPRIN表达对Tca8113细胞凋亡和细胞周期分布的改变。Transwell实验检测EMMPRIN-siRNA干扰片段转染抑制EMMPRIN表达对Tca8113细胞体外侵袭能力的影响。明胶酶谱实验检测EMMPRIN-siRNA干扰片段转染抑制EMMPRIN表达对Tca8113细胞分泌活化的MMP-2和MMP-9的表达的影响。采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。　　 结论：　　 EMMPRIN基因表达下调降低舌鳞癌Tca8113细胞的增殖和体外侵袭能力。抑制EMMPRIN基因的表达能够降低舌鳞癌细胞分泌和活化MMP-9，可能是EMMPRIN基因对舌鳞癌Tca8113细胞侵袭能力影响的机制。EMMPRIN基因表达下调对舌鳞癌Tca8113细胞的凋亡无影响。　　 第三部分 EMMPRIN基因转染影响舌鳞癌SCC-25细胞侵袭能力的实验研究　　 研究目的：　　 构建pWPT-EMMPRIN慢病毒表达载体并转染到舌鳞癌SCC-25细胞，使SCC-25细胞表达EMMPRIN，检测舌鳞癌SCC-25细胞粘附和侵袭能力的变化，同时检测EMMPRIN下游产物MMP-2和uPA的表达变化，探讨EMMPRIN表达和舌鳞癌SCC-25细胞粘附和侵袭能力的的相关性，并探讨其可能的机制。　　 材料和方法：　　 PCR获取EMMPRIN基因开放阅读框的全长片段：查询Genebank获得EMMPRIN基因序列，应用Primer5.0引物设计软件设计该基因的CDS区全序列的PCR上下游引物。应用PCR技术对目的片段进行扩增。电泳鉴定获得产物。慢病毒载体pWPT-GFP载体使用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切使其线性化，EMMPRIN基因片段使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切后的pWPT-GFP与EMMPRIN基因片段连接，大肠杆菌感受态细胞TOP10的制备及质粒转化。pWPT-EMMPRIN慢病毒载体的包装：首先制备空白慢病毒颗粒，然后空白慢病毒颗粒转染舌鳞癌SCC-25细胞，并在荧光显微镜下检测GFP的表达，测定慢病毒载体对SCC-25细胞的转染效率。同法将包装pWPT-EMMPRIN慢病毒载体。pWPT-EMMPRIN慢病毒表达载体转染SCC-25细胞，Western blot检测EMMPRIN的表达，GAPDH作为内参。　　 舌鳞癌SCC-25细胞在37℃、5％(v/v)CO2、饱和湿度的条件下，在含10％的FBS、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM培养液培养。按上步实验方法将转染pWPT-EMMPRIN慢病毒表达载体转染舌鳞癌SCC-25细胞，36-48小时后进行相关实验。细胞粘附实验检测pWPT-EMMPRIN慢病毒表达载体转染舌鳞癌SCC-25细胞后，细胞体外粘附能力的改变。Transwell实验检测pWPT-EMMPRIN慢病毒表达载体转染舌鳞癌SCC-25细胞后，细胞体外侵袭能力的改变。明胶酶谱实验检测pWPT-EMMPRIN慢病毒表达载体转染舌鳞癌SCC-25细胞后，细胞分泌的活性MMP-2的表达情况。原位明胶酶谱实验检测pWPT-EMMPRIN慢病毒表达载体转染舌鳞癌SCC-25细胞后，细胞膜上分泌的活性MMP-2表达水平。Western blot检测pWPT-EMMPRIN慢病毒表达载体转染舌鳞癌SCC-25细胞后，细胞中MMP-2和uPA的表达情况。ELISA检测pWPT-EMMPRIN慢病毒表达载体转染舌鳞癌SCC-25细胞后，细胞培养上清液中活性MMP-2和uPA的表达情况。采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。　　 结论：　　 EMMPRIN基因表达上调能够显著增强SCC-25细胞的体外侵袭能力，同时降低SCC-25细胞的粘附能力。EMMPRIN基因表达上调能够促进SCC-25细胞分泌和活化MMP-2和uPA，可能是增强其体外侵袭能力以及降低细胞粘附能力的机制之一。