昆虫变态发育主要受蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）和保幼激素（juvenile hormone,JH）两种内分泌激素调控,其中20E的前体蜕皮酮（Ecdysone）在前胸腺中合成并分泌,再在靶组织中转变为具有活性的20E。20E滴度高峰主要出现在每个幼虫龄期末期,负责启动幼虫蜕皮以及幼虫向蛹的发育转变;JH在幼虫咽侧体中合成,其高峰出现在每个幼虫龄期初期,作为一种抗变态的激素维持幼虫生长状态,阻止昆虫变态。20E和JH可以通过互相抑制相关合成途径合成酶基因的表达来抑制彼此的合成。一方面,20E通过抑制咽侧体中JH合成关键酶JH acid O-methyltransferase（JHAMT）的表达来抑制JH合成;另一方面,JH可以直接作用于前胸腺并诱导转录因子Krüppel homolog 1（Kr-h1）表达,Kr-h1继而通过与20E合成酶基因启动子直接结合并抑制其转录来抑制20E合成。尽管20E和JH对变态发育的拮抗调节作用已有较多研究,但具体的分子机制亟待深入阐释。组蛋白甲基化修饰作为一种重要的表观遗传标记,主要通过调节染色质结构来影响基因表达,从而广泛参与调控动植物各种生理过程。其中,组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K27me3）是由多梳抑制复合物2（The polycomb repressive complex 2,PRC2）负责催化发生。PRC2主要由Enhancer of zeste（E（z））、Extra sex combs（Esc）、Suppressor of zeste 12（Su（z）12）和Nucleosome remodeling factor Nurf55（Caf1-55）四个核心亚基组成,这些亚基的序列和功能在动植物中高度保守。目前比较清楚的是,PRC2通过与靶基因的启动子或增强子区域结合来促使该区域发生H3K27me3修饰,进而促进染色质浓缩,最终抑制靶基因转录。目前,H3K27me3修饰在昆虫变态发育及激素合成过程中的作用尚不清楚。因此,探究H3K27me3修饰是否调控激素合成将有助于完善昆虫变态发育的表观遗传调控网络。本研究以家蚕和果蝇为研究对象,利用遗传学、分子生物学、生物化学、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）和生物信息学分析等多种方法,从个体、组织、细胞水平探究了H3K27me3修饰对昆虫变态发育的调控作用,发现JH可以通过抑制前胸腺中的H3K27me3修饰来解除该表观遗传修饰对JH信号转导基因Hairy转录的抑制,从而实现对蜕皮激素合成及变态发育的抑制作用。主要研究结果如下:1.家蚕和果蝇前胸腺中H3K27me3水平的动态变化为了探究H3K27me3在昆虫变态发育中的功能,首先分别检测了家蚕和果蝇末龄幼虫前胸腺中H3K27me3修饰水平的动态变化。免疫荧光和Western blot实验发现,在家蚕五龄初期幼虫的前胸腺中,H3K27me3修饰水平较低;随着幼虫发育的进行,呈逐渐升高趋势,并在五龄末期达到最高。此外,在果蝇幼虫向蛹的转变过程中,H3K27me3修饰在产卵后84 h幼虫前胸腺中的水平最低,在化蛹前期即产卵后132 h达到最高。我们进一步分析了家蚕幼虫前胸腺中PRC2复合物各亚基的表达模式。RT-q PCR结果显示,Su（z）12和E（z）在末龄幼虫中的表达水平随着发育的进行呈现逐渐升高趋势,而PRC2复合物的其他亚基在末龄幼虫早期高量表达。在包含前胸腺组织的果蝇脑-环腺复合物中,Su（z）12的表达量在化蛹前期明显上调。以上结果表明,在家蚕和果蝇幼虫向蛹转变的过程中,H3K27me3修饰水平及PRC2复合物部分亚基的表达变化与20E滴度的动态变化趋势一致。2.H3K27me3修饰正调控家蚕和果蝇的20E合成及变态发育1)H3K27me3修饰正调控家蚕和果蝇幼虫向蛹的转变及20E合成为了探究前胸腺中H3K27me3修饰对昆虫变态发育的影响,我们首先用PRC2复合物活性的特异抑制剂GSK126注射幼虫五龄第五天（L5D5）的家蚕个体。分析发现,与二甲基亚砜（DMSO）处理的对照组相比较,GSK126处理导致前胸腺中H3K27me3修饰水平明显降低,但不影响H3K36me3和H3K4me3等其他组蛋白修饰的水平。表型分析显示,GSK126处理导致家蚕幼虫向蛹的发育转变明显延迟,当对照组分别处于上簇期（W0）和蛹期时,GSK126处理的家蚕仍然处于取食阶段和预蛹阶段。在果蝇中,我们利用前胸腺特异的Phm-Gal4干涉PRC2复合物各亚基的表达,结果发现前胸腺干涉Su（z）12导致H3K27me3修饰水平降低,同时引起幼虫无法向蛹转变,形成永久三龄幼虫;但其他PRC2复合物组分基因的干涉并不影响幼虫向蛹的转变。以上结果表明,家蚕和果蝇幼虫前胸腺中的H3K27me3修饰是幼虫向蛹转变所必需的。我们进一步探究了H3K27me3修饰水平对20E合成的影响。结果表明,GSK126处理家蚕幼虫以及果蝇前胸腺特异干涉Su（z）12均降低了家蚕和果蝇幼虫体内20E的滴度,并下调了脂肪体中20E信号转导基因E75B的转录。添食20E可以部分挽救GSK126处理家蚕以及果蝇幼虫前胸腺特异干涉Su（z）12所导致的发育缺陷表型。2)H3K27me3修饰正调控家蚕和果蝇前胸腺中蜕皮激素合成酶基因的转录对前胸腺中20E合成酶的表达情况进行RT-q PCR检测发现,GSK126处理家蚕幼虫以及果蝇幼虫前胸腺特异性干涉Su（z）12均使前胸腺中20E前体合成酶基因Nvd、Sro、Spo/Spok和Sad的转录显著下调。免疫荧光实验的结果也表明,干涉Su（z）12显著下调Spok蛋白表达。此外,用GSK126处理离体培养的家蚕前胸腺和果蝇脑-环腺复合物均导致H3K27me3修饰水平降低和20E前体合成酶基因转录水平下调。综合以上结果表明,H3K27me3修饰通过正向调控家蚕和果蝇幼虫的20E合成来影响幼虫向蛹的发育转变。3.H3K27me3修饰抑制JH信号转导基因Hairy的转录1)H3K27me3修饰的ChIP-seq分析为了鉴定前胸腺中发生H3K27me3修饰并调节蜕皮激素合成的靶基因,我们分别取不合成蜕皮激素的五龄一天（L5D1）家蚕的前胸腺和大量合成蜕皮激素的上簇期（W0）家蚕的前胸腺进行ChIP-seq。数据比较分析表明,L5D1和W0期家蚕前胸腺共有2089个差异峰,其中W0期特异富集的ChIP-seq峰有1506个,对应650个蛋白编码基因。进一步分析发现,在W0期被H3K27me3特异富集的有465个基因;GO功能分析显示,这465个基因主要在核酸结合和转录调节活性方面富集,涉及62个转录因子。2)H3K27me3修饰抑制JH信号转导基因Hairy的转录对上簇期（W0）家蚕前胸腺中H3K27me3修饰所富集的62个转录因子进行分析发现,JH信号通路下游的重要信号转导基因—b HLH转录因子Hairy位于其中。ChIP-seq数据和ChIP-q PCR实验分析共同表明,在家蚕末龄幼虫不同发育阶段的前胸腺中,Hairy基因的H3K27me3修饰水平呈现动态变化,W0期的水平最高。此外,分析果蝇三龄幼虫H3K27me3的ChIP-seq数据发现,H3K27me3修饰主要发生在Hairy基因的启动子区。进一步的实验显示,果蝇前胸腺中干涉Su（z）12能够明显降低Hairy启动子区的H3K27me3修饰水平。进一步探究在家蚕和果蝇前胸腺中H3K27me3修饰对Hairy转录的影响。RT-q PCR结果表明,前胸腺中Hairy表达的动态变化与血淋巴中JH滴度的变化趋势一致,与H3K27me3修饰的变化趋势相反,即在家蚕和果蝇末龄幼虫的早期,Hairy的表达水平较高;随着发育的进行,其表达水平逐渐降低,分别在家蚕W0期和果蝇产卵后132 h降到最低。此外,不论用GSK126处理家蚕幼虫还是在果蝇前胸腺中干涉Su（z）12来降低前胸腺中H3K27me3的修饰水平,均导致Hairy的转录显著上调。以上结果表明,在昆虫幼虫前胸腺中H3K27me3修饰可以靶向Hairy来抑制其转录。4.Hairy在果蝇蜕皮激素合成及变态发育中的功能1)Hairy对果蝇变态发育转变及蜕皮激素合成的影响为了探究前胸腺中Hairy对果蝇幼虫向蛹转变的影响,我们首先在前胸腺对Hairy进行干涉。结果显示,在前胸腺中干涉Hairy导致幼虫向蛹提前变态,使果蝇幼虫体内的20E滴度显著升高,并上调了脂肪体中20E信号转导基因E75B和前胸腺中20E前体合成酶基因的表达。此外,Hairy的杂合突变同样导致了过早变态和20E合成的升高。然而,用Tub-gal80ts;Phm-Gal4在三龄初果蝇幼虫前胸腺中驱动Hairy过表达,发现前胸腺过表达Hairy导致果蝇幼虫发育阻滞在三龄,果蝇幼虫体内的20E滴度、脂肪体中E75B的表达和前胸腺中蜕皮激素合成酶的表达均下降。家蚕BmE细胞和果蝇S2细胞中的荧光素酶报告实验和ChIP-PCR实验表明,Hairy通过与蜕皮激素合成酶基因Bm Spo/Dm Spok的启动子直接结合来抑制启动子活性。进一步用20E进行添食,能够挽救果蝇前胸腺过表达Hairy所导致的发育阻滞表型,成功完成幼虫向蛹的转变。2)Hairy与Su（z）12的遗传关系分析我们探究了果蝇幼虫前胸腺中Hairy与Su（z）12的遗传关系。结果显示,与前胸腺单独干涉Su（z）12相比较,Hairy与Su（z）12双干涉能够增加幼虫向蛹转变的数目并增加20E合成。当对照中的幼虫在144 h完成化蛹时,Su（z）12干涉的幼虫仍然处于取食阶段,而Hairy与Su（z）12双干涉的幼虫大约有一半完成化蛹。综上所述,昆虫幼虫前胸腺中H3K27me3通过抑制Hairy的转录来调节蜕皮激素合成。5.JH对H3K27me3修饰的抑制作用为了探究JH是否调节H3K27me3甲基化修饰,我们用JH类似物（JHM）处理离体培养的五龄六天家蚕幼虫前胸腺。结果表明,JHM处理明显减少了前胸腺中H3K27me3修饰的水平;进一步的RT-q PCR检测发现,JHM处理明显降低了Su（z）12的转录水平。类似地,用JHM处理离体培养的产卵后108 h果蝇幼虫脑-环腺复合物,导致前胸腺中H3K27me3修饰的水平以及Su（z）12基因的转录水平下调。综合分析表明,JH可以通过抑制昆虫前胸腺中H3K27me3的修饰来维持Hairy的表达。