松弛素属胰岛素家族,是由两条短肽链构成的生殖激素,对生殖系统和心血管具有重要的生理作用。人类的松弛素基因有H1、H2、H3等3种不同的序列,人体内松弛素H2是最主要的存在形式。松弛素以激素原的状态分泌,其一级结构按B链、C肽、A链的顺序排列,组织中的转化酶将C肽切除后,形成成熟的松弛素。人体内松弛素组织来源很困难,因此国内外很多研究者致力于松弛素制备方法的研究。最为常见的制备方式是化学合成A和B肽链,再进行体外折叠,因二硫键经常错配而造成产率较低。国外也有用哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母等重组表达其前体的报道,但其表达量较低或生物活性不高。根据人松弛素H2的氨基酸一级结构,本文设计带有人工C肽的松弛素H2的前体结构,即人松弛素H2前体类似物(RH2),利用酵母菌的偏爱密码子,反向编码,人工合成RH2的基因,采用pPICZaA和pGAPZaA表达载体,GS115和SMD1168毕赤酵母为宿主,成功构建了高效分泌RH2的重组毕赤酵母,在毕赤酵母中实现了RH2的高效分泌表达,再经表达产物的提取、人工C肽的切除,获得具有生物活性的重组松弛素。1.根据人松弛素H2的氨基酸一级结构,设计带有NGFNG人工C肽的松弛素H2的前体结构,利用Jcat软件优化RH2基因并人工合成;将RH2基因插入到pPICZaA和pGAPZaA表达载体Kex2信号肽切除位点的后面,构建pPICZaA-RH2、pGAPZaA-RH2表达载体,经过酶切、PCR和测序鉴定后,结果表明pPICZaA-RH2、p GAPZaA-RH2酵母表达载体构建成功。2.将重组质粒pPICZaA-RH2、pGAPZaA-RH2分别经限制性内切酶SacI、AvrⅡ线性化,将质粒pPICZaA-RH2电转导入毕赤酵母GS115中,pGAPZaA-RH2电转导入毕赤酵母GS115及SMD1168中。用高浓度的zeocin抗性筛选高效表达菌株,经PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析,成功的获得了高效分泌表达RH2的重组菌株,三株菌分别命名为pPICZaA-RH2-GS115、pGAPZaA-RH2-GS115、pGAPZaA-RH2-SMD1168。3.将重组菌pPICZaA-RH2-GS115接种于BMMY培养基中经甲醇诱导表达后,对不同时间段的表达产物进行Tricine-SDS-PAGE分析表明,36 h后目的蛋白表达量最大,经薄层扫描分析,表达的重组蛋白表达量占菌体总蛋白的47.6%,Western Blot分析显示,该蛋白具有良好的反应原性,表达量约为451μg/mL。4.将重组菌pGAPZaA-RH2-GS115置于YPD培养基诱导表达,36 h后目的蛋白表达量最大,达244μg/mL。将重组质粒pGAPZaA-RH2-SMD1168于YPD培养基诱导表达,12 h到72 h诱导目的蛋白表达量几乎没有变化,表达量达470μg/mL,纯化的重组蛋白纯度达96%,C肽切除的重组松弛素经检测具有生物活性。综上所述,我们成功地设计了松弛素前体类似物并成功在毕赤酵母中获得高效表达;经羟氨切除人工C肽后,获得具诱导THP-1细胞cAMP增加的松弛素,为其进一步研究奠定了基础。