通过激活和抑制EPCs的CMA探讨CMA和大自噬相互关系的实验研究

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目的:分别应用SB203580(吡啶异咪哒唑化合物)和6-AN(6-aminonicotinamide)作用于内皮祖细胞(endothelial progenitor cells EPCs),观察大自噬标记物LC3-Ⅱ和分子伴侣介导自噬(CMA)的标记物LAMP-2A的变化情况,探讨CMA与大自噬的关系。方法:1.密度梯度离心法分离SD大鼠的骨髓单个核细胞(bone marrow-derivedmononuclear cells, BMMNCs),EGM-2MV培养基诱导、培养、扩增骨髓源性EPCs并鉴定。倒置显微镜观察、MTT法检测EPCs增殖情况。2.在EPCs中加入不同浓度的SB203580(2.5uM、5.0uM、10uM、20uM、40uM)和6-AN(2.5mM、5.0mM、10mM、20mM、40mM),分别作用24小时。以MTT法观察药物对EPCs增殖的影响;FCM检测细胞凋亡情况;Western blot检测LC3-Ⅱ和LAMP-2A蛋白的表达情况;激光共聚焦观察细胞内LAMP-2A的变化。均数以(x±s)表示,采用单因素方差分析各组均数,(P<0.05)有统计学意义,(P>0.05)无统计学意义。结果:1.Ficoll法分离的大鼠骨髓单个核细胞,经EGM-2MV培养基培养可在体外诱导分化为EPCs。2.SB203580在浓度为2.5uM时对EPCs增殖抑制作用不明显,5.0uM及以上时抑制作用较显著(P<0.05);6-AN浓度在2.5mM时对EPCs增殖促进作用不明显,5.0mM及以上浓度时有明显促进作用(P<0.05)。3.SB203580在2.5uM时,细胞凋亡较少,5.0uM及以上时凋亡逐渐增多;6-AN各浓度组凋亡逐渐降低,在40mM时凋亡增高。4. SB203580各浓度组LC3-II蛋白呈逐渐增高趋势,Lamp-2a呈逐渐降低趋势。6-AN各浓度组LC3-II表达逐渐降低,Lamp-2a表达逐渐升高,但在40mM时两者表达均下调。5.激光共聚焦观察细胞内Lamp-2a的变化情况,6-AN组较SB203580组表现出胞浆内荧光明显的增强。结论:SB203580抑制EPCs的CMA后,大自噬增强,一定程度上抑制细胞增殖,促进其凋亡;6-AN激活CMA,大自噬表现一定程度的下调,细胞凋亡减少。CMA和大自噬之间表现出功能互补的现象,共同维持细胞功能的稳定。
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