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近年心脏起搏器技术的进展,为心跳徐缓的病人提供了一个挽救生命的治疗方法。然而心脏起搏器只是一种能缓解症状,而不能根治疾病的疗法,而且安装起搏器有重大的健康风险(如感染或死亡),其费用也十分高昂,并需要定期更换电池及导线。此外对年轻病人而言,由于他们的心脏细小且正在发育,故置入起搏器特别困难,因此迫切需要一种新的治疗方法,来解决这一问题。心脏的起搏受控于一类存在于心脏窦房结被称作I_f的离子通道,该通道是被细胞膜的超极化所激活,是起搏功能的重要组成成分。HCN是一类被命名为超极化激活及环化核苷酸调控的阳离子通道,这类基因编码的蛋白即可产生If电流,该基因已经被克隆,是目前基因治疗心率失常的研究热点。本文选取mHCN1,mHCN2基因为研究对象,采用慢病毒表达系统,用分子生物学手段将慢病毒表达载体pLL3.7进行改造:即将其原有的mU6启动子敲除,在XbaⅠ和NotⅠ之间插入真核表达启动子EF-1α和靶基因。随后使用慢病毒包装系统和表达系统转染293FT细胞,收获病毒,感染工具细胞和靶细胞,分析mHCN1和mHCN2表达的电流的不同,并选取可使电流增强的病毒注射心室壁做体内实验,使潜在起搏细胞变成起搏细胞,切除天然起搏结构—窦房结,检测起搏重建。经研究发现,构建的慢病毒表达载体可以长期稳定表达目的基因,记录到的电流大小情况是:HCN1-ΔEVY>HCN1E272A>HCN1E272A-ΔEVY>HCN1WT;HCN2E324A>HCN2WT>HCN2-ΔEVY>HCN E324A-ΔEVY。但是表达效率较低,所产生的慢病毒滴度低,即使一百倍浓缩以后仍不能达到体内动物实验的要求,需进一步改造或更换载体。HCN离子通道在心脏起搏中的作用已经得到证实,本实验的研究根据通道的分子特征,对与功能紧密相关的基因进行一系列的突变,筛选到了有增强通道功能的突变体。利用慢病毒载体携带这些基因,表明这种系统可以稳定长期表达目的基因,用于治疗心率过缓,但是仍需改进。