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成肌细胞分化是骨骼肌卫星细胞(Satellite cells, SCs)退出细胞周期并融合形成多核肌管的过程。在成肌细胞分化的过程中,钙离子／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)发挥着关键的作用,通过自身磷酸水平的变化来调节其下游靶蛋白的活性和转录活性。在骨骼肌细胞中发现的肌细胞增强因子2C (Myocyte enhancer factor 2C, MEF2C)是一种能够调控肌肉细胞分化相关基因表达的转录调控因子,具有肌肉特异性DNA的结合活性,能够与多数肌肉特异性基因的启动子区域结合。本实验室前期研究发现,在成肌分化过程中CaMKⅡ对MEF2C有调控作用,但调控机理还不清楚。本研究选用小鼠骨骼肌卫星细胞(C2C12)为细胞模型,在其诱导分化形成肌管的过程中,探讨CaMKⅡ对MEF2C的调控作用及CaMKⅡ对成肌分化的影响。同时,还对MEF2C下游肌肉相关基因肌细胞生成素(myogenin, MyoG)和肌肉肌酸激酶(muscle creatine kinase, MCK)的表达情况进行研究,以便为骨骼肌发育机理的相关研究提供实验依据。本研究选用Ionophore A23187作为CaMKⅡ活性激活剂和CaMKⅡ特异性抑制剂Kn62来进行实验。在C2C12细胞成肌诱导分化的过程中,分别使用0.41μMA23187和5μM Kn62处理细胞,设置正常诱导细胞为对照。诱导7天后,通过免疫荧光染色发现C2C12细胞经诱导形成肌管,且肌管的快肌肌球蛋白(Fast muscle myosin, FMM)成功表达。与对照组相比,A23187处理C2C12细胞后,诱导分化产生的肌管数量增多；Kn62处理细胞后,肌管的形成受到抑制,肌管数量减少。C2C 12细胞成功诱导形成肌管,说明成肌细胞诱导分化没有受到影响。在此基础上,我们探究CaMKⅡ对MEF2C的调控作用。用相同方式处理诱导分化过程中的C2C12细胞,A23187处理细胞后,CaMKⅡ和MEF2C在细胞中的总蛋白量没有明显变化(P>0.05),但CaMKⅡ和MEF2C的磷酸化水平与对照相比显著升高,其中±CaMKⅡ的磷酸化水平与对照相比显著升高1.43倍(1.4312±0.094, P<0.01; Control:1.0335±0.022, P>0.05), MEF2C的磷酸化水平显著升高1.27倍(1.2671±0.066, P<0.05; Control:1.004±0.077, P>0.05)。同时检测MEF2C下游调控基因MyoG和MCK转录水平,发现与对照相比MyoG的转录水平升高了2.64倍(2.6397±0.118, P<0.05; Control:1.0126±0.070), MCK基因的转录水平也升高了1.43倍(1.4307±0.043,P<0.05; Control:1.010±0.063)。Kn62特异性抑制CaMKⅡ磷酸化后,CaMKⅡ的磷酸化水平降低了0.55倍(0.5500±0.067,P<0.01; Control:1.0093±0.055, P>0.05), MEF2C的磷酸化水平显著降低0.58倍(0.5809±0.087, P<0.01; Control:1.0011±0.040, P>0.05),但CaMKⅡ和MEF2C在细胞中的总蛋白量没有明显变化(P>0.05)。CaMKⅡ通过调控MEF2C的转录活性,影响MEF2C下游转录因子MyoG和MCK的表达水平,结果与蛋白质免疫印迹检测结果的一致。MyoG和MCK的转录水平分别降低了0.47倍(0.4661±0.068, P<0.01; Control:1.0126±0.070, P>0.05)和0.53倍(0.5337±0.054, P<0.01; Control:1.0100±0.064, P>0.05)。经免疫共沉淀、激酶分析和Western Blot检测后发现ATP体外激活CaMKⅡ的激酶活性,可以直接调控MEF2C的磷酸化水平。我们从这些新的证据中得到以下结论：在C2C12细胞成肌分化的过程中,CaMKⅡ能够直接正调控MEF2C的活性及转录活性,进一步调控C2C12细胞成肌分化相关基因的表达,进而促进成肌细胞的分化。上述结果对深入研究CaMKⅡ对MEF2C的活化机制及其细胞生理功能,对肌肉肥大等相关疾病的治疗具有重要参考价值。