哺乳动物成年后睾丸支持细胞的数量决定了睾丸大小和日精子产量,每个睾丸支持细胞所能供养的生殖细胞数目是一定的。细胞周期蛋白激酶抑制蛋白1B p27Kip1(p27),是成熟睾丸支持细胞的一个标志蛋白,p27主要通过与细胞周期蛋白激酶2(CDK2)结合影响其活性,而参与调控细胞周期进程。SUMO化修饰可以影响蛋白质的活性,稳定性,蛋白质之间的相互作用和亚细胞定位和蛋白质的运输。本研究的主要目的是探索p27能否被SUMO化修饰,确定p27的SUMO化修饰位点,并阐明p27的SUMO化修饰对睾丸支持细胞细胞细胞周期的影响。实验设计如下:本课题首先用免疫组织化学和western blot的方法检测p27在0天、4天、10天和42天小鼠睾丸中的定位和表达情况(Takuya Sato et al 2011)。利用敏感型细胞、CHO-K1作为实验材料,通过转染SUMO-1、UBC9、p27和p27点突变载体,探讨p27的SUMO化修饰模式,筛选p27的SUMO化修饰位点以及SUMO化修饰对p27稳定性的影响。分离培养7天小鼠睾丸支持细胞,转染p27和p27点突变载体,流式细胞仪检测细胞周期。实验结果:(1)p27在各个时期的睾丸中均有表达,而且存在磷酸化,泛素化和SUMO化等多种蛋白翻译后修饰,p27在10天的小鼠睾丸中表达水平显著高于其它时,主要定位于生殖细胞、部分支持细胞和间质细胞的细胞核内,而42天小鼠睾丸中主要定位于支持细胞的细胞核内;(2)p27可以被SUMO-1修饰,修饰发生在Lys189,并且SUMO-1修饰位点突变后p27的蛋白水平显著下降(P<0.05);(3)睾丸支持细胞转染p27后,细胞周期G1期显著增加(P<0.05),转染p27K190R突变载体后细胞周期G1期显著增加(P<0.05),2种突变p27 K189R和p27 K189AK/190R质粒转染后对细胞周期没有影响。综上所述,本研究筛选出小鼠p27的SUMO化修位点是Lys189,p27的SUMO化修饰可以增强p27的稳定性,并使支持细胞的细胞周期阻滞在G1期。该研究结果为研究睾丸癌机制及p27功能的研究提供理论依据,为提升雄性动物繁殖性能提供新的思路。