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目的研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在体外增殖性感染小鼠胚胎成纤维细胞以及研究细胞表面的硫酸乙酰肝素与HCMV感染小鼠胚胎成纤维细胞的吸附过程的关系。方法(1)取本实验室保存的HCMV AD169株,复苏增殖后采用空斑形成试验滴定病毒感染性。以MOI=100接种至BALB/c小鼠胚胎成纤维细胞(MF)和人胚胎成纤维细胞(HF),镜下逐日观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE)并传代三次。待出现细胞病变后采用PCR和RT-PCR分别检测HCMV特异性基因IE和UL83的复制和转录。并且经透射电镜观察细胞内的病毒颗粒。同样的培养物分别在感染后第1、2、3、5、7、10、14天收集细胞培养液,采用空斑形成试验分别测定感染HCMV后不同时间的MF细胞和HF细胞培养液中的感染性病毒数量。(2)将不同浓度的肝素和肝素酶分别与定量HCMV共同接种至已长成单层的BALB/c小鼠胚胎成纤维细胞及人胚胎成纤维细胞,采用空斑形成试验分别测定HCMV病毒感染组、肝素组和肝素酶组吸附感染细胞的病毒数量;采用RT-PCR方法检测各组HCMV IE mRNA的表达。结果(1)将HCMV以MOI=100分别接种至MF细胞和HF细胞后,可观察到MF细胞出现病毒所致CPE,与HF细胞上的CPE相似,表现为细胞肿胀变圆,胞内颗粒增多,折光性增强。将培养物连续传代三次,仍然可观察到明显CPE。细胞培养物经PCR、RT-PCR检测HCMV UL83、IE基因及其转录产物均阳性。经透射电镜观察,在MF细胞胞质及胞核内均可见疱疹病毒样颗粒及病毒包涵体,病毒颗粒直径大小不一,约为100～200nm。将HCMV以MOI=100分别接种至MF细胞和HF细胞后,连续两周观察其CPE。发现受感染的MF细胞和HF细胞在第4～5d均可见细胞肿胀变圆,胞内颗粒增多,折光性增强;在第7d出现明显广泛的CPE;至第10d左右可见病变程度进一步加重,几乎全部细胞均已发生严重病变;第12～14d时,病变的细胞开始逐渐死亡脱落。感染后不同时间的细胞培养液经空斑形成试验测定感染性病毒量,结果显示MF细胞培养液中感染性病毒数量从第3d开始上升,为1.5×103PFU/ml;随后不断上升至第10d达到高峰,为1.2×108PFU/ml;第14d时随着病变细胞的死亡脱落,细胞培养液中感染性病毒量下降。此结果与HF细胞培养液的结果基本一致。(2)肝素与肝素酶抑制HCMV的空斑形成试验结果可见,与病毒感染组相比,肝素组与肝素酶组HCMV在MF细胞上形成的PFU明显减少,且肝素与肝素酶浓度越高PFU减少越明显,具有剂量依赖性。HCMV IE基因的RT-PCR检测结果,经Bioscience image anlysis system进行灰度值分析显示,肝素组和肝素酶组MF细胞HCMV IE基因相对表达水平较病毒感染组细胞降低,差异有显著性(P <0.01)。结论证实了HCMV在体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞中可以增殖性感染;并且利用硫酸乙酰肝素类似物-肝素以及硫酸乙酰肝素抑制剂-肝素酶,证实了HCMV与小鼠胚胎成纤维细胞的首次结合是由细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖介导的,用肝素和肝素酶处理均可降低病毒对细胞的结合力。