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随着酶工程、基因工程以及蛋白质组学的不断发展,脂肪酶在手性药物中间体合成中的应用变得更为广泛。如何高效快速地从生物体内提取具有立体选择性的脂肪酶已成为生物学领域的一个关键性问题。目前蛋白质组学的热门话题之一——活性探针,是一种可标记特定蛋白质的小分子,已被报导用于分离提纯生物体内具有重要医学和生物学价值的蛋白质。本课题以实验室保藏的脂肪酶产生菌Aspergillus tamarii ZJUT ZQ013为研究对象,设计并合成相应的活性探针,通过层析的方法从菌体中快速分离纯化靶标脂肪酶,并对其结构进行分析与鉴定,再通过基因工程的方法进行克隆和表达,最后研究其酶学性质及动力学参数。我们分别以外消旋的、D-型以及L-型的N-Boc-2-氨基丁酸为识别基团,设计并合成三种对应构型的活性探针:Rac-amio-probe,D-amio-probe,L-amio-probe,并对其进行表征。该探针的报告基团为生物素,便于后续目的酶的富集与纯化。同时,该探针是通过“点击化学”的方式将报告基团与识别基团相连。然后将活性探针Rac-amio-probe与Aspergillus tamarii ZJUT ZQ013粗酶液共同孵育,再利用活性探针分子上的生物素报告基团与链霉素结合进行亲和层析,最终达到从微生物细胞中快速提取靶标脂肪酶的目的。SDS-PAGE结果表明,该目的酶的分子量为38kDa,并对其进行质谱鉴定及N-端测序。以商品化的脂肪酶为对照,进行活性探针的特异性标记实验。SDS-PAGE结果显示该探针能够特异性识别并分离靶标酶。将三种构型的手性探针（Rac-amio-probe,D-amio-probe,L-amio-probe）分别作用于粗酶液,来研究靶标酶的立体选择性。SDS-PAGE结果表明,该靶标酶能水解外消旋的和L-型的氨基丁酸酯,从而得到对应的（S）-型的氨基丁酸,也证明了该酶的立体选择性。从Aspergillus tamarii ZJUT ZQ013中提取总RNA,并反转录为cDNA,再以其为模板,PCR扩增基因片段。将该基因片段通过TA克隆连接至pEASY-E2载体上并在E.coli BL21（DE3）中成功表达。诱导后的菌体经测定其比活力为1528.5U/L,相对于野生菌的酶活提高了近10倍。经测序可知Aspergillus tamarii ZJUT ZQ013酯酶基因序列全长921bp,编码306个氨基酸,将其氨基酸序列于NCBI蛋白质数据库中BLAST比对发现,该蛋白与酰基甘油脂肪酶有很高的相似度。在重组酶二级结构中,以β折叠和无规则卷曲为主。利用同源建模对该酶的三维结构进行了预测,为进一步深入研究该酶的催化机制打下基础。通过Ni-NTA柱亲和层析分离纯化得到纯酶,并对其酶学性质及动力学参数进行研究。发现该酶倾向于水解短链的三酰甘油酯。其最适pH为8.5,而且该酶在较宽的pH范围内是稳定的。最适温度是40℃。在50℃以下,该酶具有较好的热稳定性。Fe2+对酶有促进作用,Cu2+和Mn2+对酶有抑制作用。甘油、DMSO、丙酮、正己烷以及甲苯能提高酶活,THF抑制酶活力。Tween 20、Tween 80及Triton X-100对酶有激活作用,SDS显著抑制酶活。EDTA、PMSF和DEPC显著抑制酶活性。DTT促进酶活力。重组酶对p NPA的Km为5.2 mM,Vmax为30.12U/mg,说明该酶对底物有较好的亲和力。本课题首次利用活性探针的方法从微生物细胞中快速提取立体选择性脂肪酶,并对该酶的性质进行了初步研究。本实验中活性探针的识别基团为酶的作用底物本身,为活性探针的设计提供了新思路。同时,该探针的识别基团是可变的,为今后不同酶的分离纯化提供了新方案。