第一部分：儿童急性淋巴细胞白血病Bcl-2基因表达、细胞凋亡与临床相关性研究 目的：了解凋亡抑制基因Bcl-2表达与细胞凋亡和临床的关系。 方法：利用细胞原位杂交技术和吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)荧光染料双重染色检测20例正常对照儿童和30例ALL患儿治疗前后不同时期Bcl-2mRNA表达和细胞凋亡。 结果：93.3％ALL患儿存在Bcl-2mRNA阳性表达，并随着治疗好转其表达率下降，而正常对照组无表达。病例组中Bcl-2mRNA表达水平存在明显的个体差异(CV=38.7％)。根据ALL患儿Bcl-2mRNA表达水平将其分为高表达(＞20％)和低表达(≤20％)两组。Bcl-2mRNA表达水平与ALL临床分型关系密切，高危型者阳性细胞率高，与标危者比较差别有极显著性(t=11.50，P＜0.01)。但与患儿年龄、性别、血红蛋白量、血小板及骨髓幼稚细胞比例无关(P＞0.05)。ALL治疗前自然凋亡指数(AI)为(8.58±3.24)％，较正常对照组明显减低(t=5.42，P＜0.01)。治疗前Bcl-2mRNA表达水平与AI呈负相关(r-0.76，P＜0.01)。经泼尼松敏感治疗和诱导缓解治疗，AI明显升高，且AI升高程度在Bcl-2mRNA低表达组显著高于高表达组(t分别为4.54；4.01，P均＜0.01)。诱导缓解治疗第19天骨髓检查，Bcl-2mRNA低表达组完全缓解率高于高表达组(P=0.0012)。动态观察5例高危型患儿Bcl-2mRNA表达水平始终在10％以上，12月内有3例出现中枢神经系统白血病，2例骨髓复发。而5例标危型患儿Bcl-2mRNA水平始终在较低水平，阳性细胞率＜5％，骨髓检查持续完全缓解，且无髓外白血病发生，其中1例患儿在24月时，Bcl-2mRNA表达高达20％，于28月时骨髓复发。 结论：1、ALL患儿存在程度不同的Bcl-2mRNA阳性表达，其表达水平与同期细胞凋亡指数呈负相关，且与临床分型、早期治疗反应和早期骨髓缓解程度密切相关。2、治疗前检测Bcl-2mRNA有利于危险程度的评估和原发耐药的评价。3、动态检测有利于继发耐药的评估，可作为化疗敏感性的可靠指标。 第二部分：儿童急性淋巴细胞性白血病T细胞受体基因重排与临床研究 目的：探讨T细胞受体基因的Vδ2Dδ3重排片断在儿童急性淋巴细胞性白血病中的临床意义。 方法：以TCRVδ2Dδ3重排片断为白血病细胞的克隆特异性标志，筑巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)方法定性检测白血病细胞的存在与否。 结果：对58例ALL进行了TCRVδ2Dδ3基因重排检测，在41例B-ALL中，34例(83％)和4例T-ALL中1例检出克隆性TCRVδ2Dδ3基因重排。58例ALL中44例155次进行了TCRVδ2Dδ3基因重排的动态检测。维持强化治疗期间，TCRVδ2Dδ3基因重排检测由阴性转为阳性或持续阳性者，易引起骨髓复发，预后差。经系统性治疗3年以上，TCRVδ2Dδ3基因重排持续阴性者，可作为停药治疗的一个有效指标。 结论：1、ALL患儿存在着TCRVδ2Dδ3基因重排，在B-ALL中，TCRVδ2Dδ3基因重排阳性率高达83％。2、检出TCRVδ2Dδ3基因重排，提示体内存在白血病细胞。3、动态检测对判断疗效、预测复发、指导治疗和决定终止治疗时间均有重要的临床意义。 第三部分：尼莫地平对儿童急性非淋巴细胞性白血病化疗增效的研究 目的：了解钙道拮抗剂尼莫地平在儿童急性非淋巴细胞性白血病的化疗增效效应。 方法：28例患儿采用DA(柔红霉素+阿糖胞苷)方案治疗2个疗程，骨髓原始+早幼粒细胞仍＞20％，在原DA方案的基础上加用尼莫地平(30mg/m2.d×7d)化疗1疗程。 结果：13例患儿达完全缓解，完全缓解率为46.4％，14例达部分缓解，1例未缓解，总有效率为96.4％。 结论：尼莫地平能增强DA方案对儿童急性非淋巴细胞性白血病的治疗效果。 第四部分：尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡影响的研究目的：了解钙通道拮抗剂尼莫地平(NMDP)对阿糖胞苷诱导HL-60细胞株凋亡的影响。 方法：以HL-60细胞株为研究对象(AFS)，DNA凝胶电泳检测各实验组HL-60细胞凋亡率。 结果：①一定浓度的阿糖胞苷能诱导HL-60细胞株凋亡，其中以0.1mg/ml组凋亡率最高，24h凋亡率(70.00±2.00)％，1mg/ml组最低，24h为(14.33±1.53)％，同时伴有坏死细胞增多。同一浓度的阿糖胞苷其凋亡率随着培养时间的延长而增加。②单独应用NMDP无诱导HL-60细胞凋亡的作用。③NMDP与阿糖胞苷合用HL-60细胞凋亡率明显高于单纯阿糖胞苷组。 结论：阿糖胞苷能诱导HL-60细胞凋亡，单纯应用NMDP不能诱导细胞凋亡，NMDP与阿糖胞苷合用能明显增强阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡的效果。 第五部分：尼莫地平加强阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡的机制研究 目的：探讨尼莫地平(NMDP)加强阿糖胞苷(Ara-c)诱导HL-60细胞凋亡的作用机制，为尼莫地平在临床上逆转白血病耐药提供理论依据。 方法：以HL-60细胞株为研究对象，采用Giemsa染色观察凋亡细胞的形态学变化，琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞的DNA片断，采用细胞免疫组化方法检测凋亡细胞的凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达。 结果：实验组自培养8小时起，HL-60细胞可见不同程度的变形、体积变小、出泡，小泡散落于细胞周围。细胞和小泡仍保持膜的完整性。随着培养时间延长，出泡细胞增加，细胞体积变小，密度减少，且伴有细胞坏死现象。Giemsa染色可见核膜裂解，染色质呈紫红色或蓝紫色，分割成块状，浓缩、靠近核膜，呈边集现象，并具有典型的凋亡小体形成。琼脂糖凝胶电泳发现典型的DNA梯形凋亡带。Bcl-2蛋白表达在各实验组随培养时间延长逐渐下降，而Bax蛋白的表达则逐渐增加，Bcl-2/Bax比值逐渐下降，8小时就与对照组出现差异(P＜0.05)。 结论：.尼莫地平及Ara-C均能促进HL-60细胞凋亡，其机制与下调bcl-2及上调Bax基因的蛋白表达有关。尼莫地平的确能加强Ara-C促进HL-60细胞凋亡的效果，其机制可能与协同下调bcl-2的表达有关。