舍格伦综合征、放射性涎腺炎、Steaven-Jounson综合征、药物过敏或自身免疫性疾病等各种原因造成的涎腺分泌功能严重损害的疾病十分常见，给人类的生存质量带来很大影响，治疗问题仍然十分棘手。近年来，随着细胞生物学和材料学的发展，应用组织工程学的方法体外培养具有生物活性且在结构和功能上与自体颌下腺相类似的组织工程化颌下腺成为可能。 在组织工程化颌下腺体外培养体系的构建研究中，如何获取大量成活率高且保持其增殖、分化及分泌功能的颌下腺细胞是进一步实验研究的基础。目前有关颌下腺体外培养的实验研究没有一个相对成熟的涎腺细胞生长和分化的体外培养系统。虽然绝大多数细胞均可在体外培养，但由于对各种细胞在体内生存环境的了解程度不同而使培养细胞与体内细胞仍然存在着生长、增殖和功能差异。细胞体外培养的功能差异指在体外培养条件下，细胞降低甚至丧失了其在体内的合成、分泌等功能，即细胞的分化特性减弱或不明显。细胞在培养条件下的功能降低和丧失对组织工程研究影响十分巨大。如果在培养过程中使细胞的生存环境得到改善，细胞就能恢复这种分化特性。如果培养的细胞没有其特定功能，则注定不能发挥其应有作用，亦无法构建真正的组织和器官。因此，必须在改善体外细胞培养环境方面不懈努力，使目的细胞保持其特有的功能。 本实验研究目的是建立组织工程化颌下腺(submandibular gland,SMG)细胞的分离纯化及其体外培养体系；研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对体外培养的SMG细胞生长状态和分泌功能的影响；并对优化条件下SMG细胞在胶原海绵支架复合生长特性进行分析，构建理想的体外组织工程化SMG培养系统，为组织工程化SMG的研究奠定基础。实验方法 1.应用胰酶消化法进行SMG细胞的分离纯化，然后进行SMG细胞原代培养和传代培养。 2.应用相差显微镜观察培养细胞的形态结构，绘制原代、第2代和第4代培养细胞的生长曲线，了解细胞的生长特性。 3.用台盼蓝排除试验检测细胞存活率。 4.培养细胞经MTr法检测490lun吸光度A值，判断细胞活力大小。 5.培养细胞的透射电镜(trans而ssion eleetron而eroseope，TEM)观察结合免疫组织化学检测鉴定细胞来源及性质。测定培养细胞的淀粉酶含量，评价培养细胞的分泌功能。 6.加人不同浓度的HGF进行细胞培养，得出生长因子对大鼠SMG细胞增殖的剂量一效应、时间一效应关系，评价HGF对体外培养大鼠SMG细胞增殖的影响。 7.大鼠培养细胞RT一PCR检测淀粉酶的基因表达;免疫印迹法(West-ern blotting)检测淀粉酶蛋白质。 8.将传代培养的第2代细胞接种于胶原海绵表面进行培养，HE染色光镜观察、扫描电子显微镜(seanning eleetron而eroseope，SEM)观察胶原海绵上接种SMG细胞形态结构特点。实验结果 一、大鼠SMG细胞培养及生物学特性 1.培养细胞的相差显微镜观察:整个SMG细胞生长期间为多样性的上皮细胞，无成纤维细胞混杂生长。细胞可传4一5代，成活30一40天。(l)原代培养:刚获取的细胞呈球形，呈悬浮状态，细胞接种后24h贴壁，胞质展开，折光性减低。培养72h后，可见完全伸展的细胞呈扁平多边形，细胞浆为颗粒状，胞核清晰，细胞数量增多。细胞培养至96h，可见新生的SMG细胞，呈大小均一的铺路石状。(2)传代培养:传代后细胞生长较原代加快，24h左右即可贴壁伸展，第2代细胞形态与原代相似呈多角形。细胞经反复传代后形态出现变化，从第3代起出现个别体积较大的”巨细胞”并形成少数空泡。传代次数增加，”巨细胞”数量增加。第5代，细胞以“巨细胞”为主，且形态逐渐由多边形变得不规则，有的细胞伸出长长的突起与邻近细胞相接。细胞界限模糊，胞核散大，胞内出现细小空泡及黑色小颗粒，细胞增殖减慢甚至停滞，脱壁细胞增多，部分细胞死亡形成空泡。 2.SMG培养细胞的生长特性:描绘细胞生长曲线，观察细胞的生长特性。原代:接种后第2天生长平缓，表现同生长曲线潜伏期。第3天开始呈快速生长，构成生长曲线的对数生长期。细胞倍增时间在接种后第5天，6一8天达到高峰，形成平台期，此后细胞数目增长缓慢。第2代细胞保持旺盛增殖，于接种次日就进人快速生长的对数生长期，在其生长曲线上无明显的潜伏期，细胞倍增时间在接种后第4天，同原代细胞生长曲线相比第2代细胞的生长曲线左移。第4代细胞数目增长缓慢，细胞生长能力明显减弱。 3.培养细胞活力的检测:(1)细胞活性观察:接种前用台盼蓝排除试验分别检测细胞的存活率(观察视野n二6)，原代平均为%%，第2代平均为98%。第4代平均为75%。(2)细胞增殖测定:随培养时间延长，各组细胞数量都有不同程度的增加，比较培养72h原代、第2代与第4代细胞吸光度值，原代、第2代与第4代相比较有显著性差异(P<0.05)。 4.体外培养SMG细胞的功能测定 SMG细胞培养上清淀粉酶含量测定:原代培养和传代培养第2代、96小时的培养上清淀粉酶含量较高并且可维持一定水平。传代培养第4代96小时的培养上