【摘 要】
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目的:1.制备人脂肪组织脱细胞基质(DAT)并初步检测其脱细胞效果;2.通过自主研发的可控温软组织匀浆装置,制备出可顺利通过27G针头的注射型DAT匀浆;3.对DAT匀浆进行肉眼、扫描电镜(SEM)观察并探讨DAT匀浆培养下ADSCs粘附率及增殖情况;4.将DAT匀浆、DAT匀浆+ADSCs、颗粒脂肪分别注射入大鼠背部,对比这三组的填充效果、血管数量、炎症浸润情况。方法:1.取正常脂肪组织经反复冻
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目的:1.制备人脂肪组织脱细胞基质(DAT)并初步检测其脱细胞效果;2.通过自主研发的可控温软组织匀浆装置,制备出可顺利通过27G针头的注射型DAT匀浆;3.对DAT匀浆进行肉眼、扫描电镜(SEM)观察并探讨DAT匀浆培养下ADSCs粘附率及增殖情况;4.将DAT匀浆、DAT匀浆+ADSCs、颗粒脂肪分别注射入大鼠背部,对比这三组的填充效果、血管数量、炎症浸润情况。方法:1.取正常脂肪组织经反复冻融、酶消化、有机溶剂提取脂质等处理制备脂肪组织脱细胞基质。肉眼观察基质性状,行HE、Masson以及DAPI荧光染色观察脱细胞效果;2.按照前期探索的匀浆适宜条件:VDAT:V生理盐水=1:12,转速8000r,匀浆时间10min,制备可通过27G针头的DAT匀浆并用扫描电镜观察DAT匀浆显微结构;3.取第3代人ADSCs与DAT匀浆复合培养,观察其细胞黏附能力以及用CCK8检测细胞增殖活性;4.取清洁级雄性Wistar大鼠20只,将0.5ml DAT匀浆、DAT匀浆+ADSCs、颗粒脂肪分别注射至大鼠背部脊柱两旁对称部位。分别于移植后第1、2、4、8w取材,大体观察其标本情况、用排水法测量其填充物体积,显微镜下观察其血管数量并统计,使用Image-Pro Plus测量CD68免疫组化切片的平均光密度来反应炎症浸润情况并观察其有无脂肪细胞生成,所统计的数据均使用SPSS26.0软件进行数据分析。结果:1.DAT呈乳白色、结构疏松,表面非常光滑,有一定光泽和弹性;HE、Masson染色未见明显脂肪细胞结构,可见排列紧密的基质蛋白;DAPI荧光染色未见明显阳性细胞核,证明脂肪组织脱细胞彻底;2.DAT经过匀浆机在8000r10min的特定条件下进行处理后,变成白色不透明匀浆,并顺利通过27G针头,扫描电镜观察DAT匀浆呈多孔样结构,遍布纵横交错的基质蛋白,其粒径大小约为(749.91±136.79)nm。3.测得ADSCs在匀浆中的黏附率为(92.16±1.00)%;细胞与DAT匀浆复合培养后,CCK-8检测显示随时间延长OD值不断升高,细胞生长情况良好,匀浆对细胞无毒性;4.将颗粒脂肪、DAT匀浆、DAT匀浆+ADSCs分别注入大鼠背部,分别于1、2、4、8w取材,通过排水法测量体积发现,DAT匀浆、DAT匀浆+ADSCs的填充效果好于颗粒脂肪组,移植后第8w DAT匀浆、DAT匀浆+ADSCs的体积分别与颗粒脂肪组间具有明显的统计学差异(P值均<0.05)。三组移植物注射到大鼠背部后,移植物表面均形成薄膜,薄膜表面有新生血管。染色结果提示移植物注射到大鼠背部后,均有不同程度的炎症细胞浸润,血管形成,随着移植时间的延长,纤维化程度加重,颗粒脂肪组有大量脂肪细胞坏死融合,形成油囊,而DAT匀浆、DAT匀浆+ADSCs未见明显降解,并有部分脂肪细胞生成。CD31染色结果提示三组移植物血管数量随着移植时间延长均呈现先上升后下降的趋势,但DAT匀浆组及DAT匀浆+ADSCs组均高于颗粒脂肪组,并具有统计学意义(P<0.01)。CD68染色结果提示三组移植物注射入大鼠背部后均产生不同程度的炎症反应,并随着移植时间的延长炎症反应逐渐降低,但DAT匀浆组及DAT匀浆+ADSCs组均低于颗粒脂肪组。结论:1.利用脱细胞技术,可以成功将脂肪组织制备成脱细胞脂肪组织基质;2.使用自主研发的匀浆装置,设定特定的条件,可以将DAT制备成为通过27G针头的DAT匀浆;3.DAT匀浆具有良好的生物相容性,ADSCs在DAT匀浆上增殖、黏附良好;4.DAT匀浆具有填充优势,其单纯匀浆或是带有ADSCs的混合匀浆,炎症反应均相对于颗粒脂肪组较轻,形成的血管数量较多,并有脂肪细胞生成,填充效果均好于颗粒脂肪填充。
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