流行病学资料和大量临床及实验数据显示,尼古丁作为香烟烟中的主要成瘾成分之一,可以引起人体多种心血管系统和呼吸系统疾病,如:动脉粥样硬化、慢阻肺、肺癌等.内皮细胞在香烟烟、细菌内毒素、肿瘤坏死因子、白介素等炎性介质的刺激下可以表达多种粘附分子,如细胞间粘附分子1、血管细胞粘附分子 1 和E-选择素等.内皮细胞粘附分子的表达存在时效性.不同时段可以表达不同类型的粘附分子,其产生的机制也不同.粘附分子通过识别其相应的配体而介导血流中的白细胞与血管内皮细胞的快速粘附和牢固粘附,帮助白细胞穿越内皮间隙向局部组织募集.内皮细胞/白细胞的粘附在机体免疫应答中具重要地位.女性在绝经期前心血管疾病的发生率明显低于绝经期后,这种差异可能与雌激素的作用有关.由于雌激素与炎性细胞及细胞因子之间有着错综复杂的相互作用,并与多种炎性疾病的发生发展密不可分,所以,研究雌激素在体内对炎性介质介导的内皮细胞粘附分子表达的调控具有重要的理论意义和临床指导价值. 本研究的目的是观察长、短时效尼古丁对内皮细胞粘附分子(ICAM-1、E-selectin、VCAM-1) 表达的影响,并对雌二醇影响该过程的调控机制进行分析,从而解释雌激素是如何影响内皮损伤以及炎性疾病进程的. 第一部分:尼古丁对巨噬细胞介导的血管内皮细胞粘附分子表达的长时效作用和雌激素的调控作用及机制的研究 本研究的目的是观察不同浓度的尼古丁对巨噬细胞(Ana-1)细胞因子及人脐带静脉血管内皮细胞(HUVECs)粘附分子ICAM-1、VCAM-1及E-selectin表达的影响,以及雌激素对这一过程的调节作用. 将体外培养的巨噬细胞.Ana-1分组,分别给与单纯培养基,不同浓度尼古丁(2x10<-5> M、6x10<-5> M、1x10<-4> M、2x10<-4> M)处理3、6、12、24、48 h后,用放射免疫分析和ELISA方法检测巨噬细胞的细胞因子的产生.然后收集相应的巨噬细胞上清,并用此上清处理血管内皮细胞3、9、12、24 h,半定量RT-PCR和ELISA方法检测粘附分子ICAM-1/sICAM-1、VCAM-1/sVCAM-1、E-selectin/sE-selectin的mRNA和蛋白质的表达.用TNF-a、IL-1B、IL-8、IFN-γ中和性抗体分别对上清中的相应细胞因子中和,再进行粘附阻断试验判断上清中发挥作用的细胞因子.我们将雌二醇(100 nM)或睾酮(100 nM)与不同浓度尼古丁(2x10<-5>M、1x10<-4> M、2x10<-4> M)或雌激素受体拮抗剂Tamoxifen与雌二醇,雄激素受体拮抗剂Cyproterone与睾酮分别和尼古丁联合作用于巨噬细胞,对其上清中的细胞因子用放射免疫分析和ELISA方法进行检测.RT-PCR和Western Blot方法检测Ana-1细胞内性激素受体存在情况. 结果显示: 1、尼古丁对Ana-1介导的血管内皮细胞粘附分子表达的影响6x10<-5>M的尼古丁处理后的Ana-1上清在9、24 h分别使内皮细胞粘附分子VCAM-l/sVCAM-1和ICAM-l/slCAM-1表达达到最高. 2、尼古丁对Ana-1细胞因子表达的影响①6x10<-5>M的尼古丁可以在12和24h时间点上分别使Ana-1细胞的IL-1β、TNF-a表达到最高,而对IL-8、IFN-γ,的影响不显著.②IL-1β和TNF-a的中和性抗体能有效的阻断单核细胞对活化内皮细胞的粘附. 3、性激素对Ana-1细胞因子表达的影响①雌二醇对Ana-1细胞分泌的IL-1β、TNF-a的表达起抑制作用,而睾酮的调节作用不显著.②性激素对IL-8、IFN-γ,的调节作用不显著. 4、性激素受体在Ana-1细胞的表达巨噬细胞内有雌激素受体存在,没有检测到雄激素受体. 综上所述,尼古丁可以上调血管内皮细胞粘附分子的表达,这一作用主要是通过巨噬细胞分泌的IL-1β、TNF-a介导的.雌二醇可以显著抑制巨噬细胞中的细胞因子的表达,而雄激素则没有明显作用.我们推测,雌激素对血管炎性病变的保护作用是通过降低细胞因子的表达水平进而下调粘附分子的表达来实现的,这～过程可能是由胞内的雌激素受体介导. 第二部分:尼古丁对血管内皮细胞粘附分子表达的短时效作用和雌激素的调控作用及机制的研究 有关尼古丁触发血管内皮细胞的粘附分子快速活化的机制报道不一,雌激素在此过程中所起的作用和机制也尚不清楚.本研究在继探讨了尼古丁长时效作用之后,主要目的是观察尼古丁诱发血管内皮细胞粘附分子表达的短时效作用,探讨雌二醇在尼古丁诱导的粘附分子表达过程中的调节作用及其作用机制. 我们将体外培养的血管内皮细胞分别予以10-100/μM尼古丁和1-100nM 雌激素(E<,2>)/E<,2>-BSA,以及尼古丁受体非特异性阻断剂美加明(Mecamylamine),尼古丁 a7 受体阻断剂银环蛇毒素(a-bungarotoxin),雌激素受体拮抗剂 Tamoxifen 等的处理,通过Fura-2 荧光标记法观察细胞内钙离子浓度的变化.然后用分别用60/μM尼古丁,雌二醇与尼古丁联合,以及 Tamoxifen、Mecamylamine、a-bungarotoxin,钙通道阻断剂维拉帕米(Verapamil)等分别处理内皮细胞15、30、60 min,用Western blot法观察其对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员ERK1/2、p38和JNK磷酸化的影响.用尼古丁的两种受体阻断剂,MAPK家族的阻断剂PD98095、SB203580和BAPTA与尼古丁联合处理血管内皮细胞后,用实时定量PCR、流式细胞术、ELISA和 Western blot 方法观察对血管内皮细胞粘附分子的表达情况.用RT-PCR,流式细胞术和激光共聚焦显微镜方法观察内皮细胞表面雌激素受体的存在情况. 结果显示: 1、尼古丁受体阻断剂,细胞内钙对尼古丁诱导血管内皮细胞粘附分子表达的作用①6x10<-5>-1x10<4> M的尼古丁可以引起血管内皮细胞内钙离子浓度的显著升高,此变化可以分别被Mecamylamine、a-bungarotoxin 阻断.②Mecamylamine、a-bungarotoxin 和钙通道阻断剂能明显阻断尼古丁对MAPK家族成员的活化.③Mecamylamine、a-bungarotoxin可以明显阻断血管内皮细胞粘附分子的表达. 2、MAPK家族对尼古丁诱导血管内皮细胞粘附分子表达的作用①6x10<-5>M的尼古丁可以在15 rain时引起血管内皮细胞中的MAPK家族中的ERK1/2、p38的最大活化,然后随时间呈下降趋势,但对JNK的活化作用不显著.②Mecamylamine、a-bungarotoxin和钙通道阻断剂能明显阻断尼古丁对MAPK家族成员的活化.③MAPK家族成员抑制剂PD98095、SB203580可以明显阻断血管内皮细胞粘附分子的表达. 3、雌二醇对尼古丁诱导血管内皮细胞粘附分子表达的调控作用①雌二醇/E<,2>-BSA可以引起内皮细胞的胞内钙离子浓度的升高,此变化不能被Tamoxifen阻断.②雌二醇可以下调尼古丁诱导的ERK1/2和p38的活化,Tamoxifen不能阻断此作用.③雌二醇可以下调粘附分子VCAM-1和E-selectin的表达.PD98095、SB203580和BAPTA对此过程有阻断效果. 4、雌激素受体在血管内皮细胞的表达内皮细胞表面存在雌激素受体. 上述结果表明:尼古丁主要通过尼古丁a7受体,钙离子信号和MAPK家族的信号传递来活化血管内皮细胞,诱导粘附分子的表达.雌二醇可以降低尼古丁对粘附分子的这一作用.由于尼古丁是参与介导动脉粥样硬化发生发展的重要因素,本研究结果提示雌激素通过钙离子和MAPK家族介导的快速信号途径对尼古丁诱导的血管内皮细胞粘附分子表达的抑制作用可能是其抗粥样硬化的机制之一.