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堆肥是修复石油污染土壤的重要技术之一。微生物在堆肥过程中对石油的降解起着关键作用,然而,鉴于土壤微生物的复杂性和不同生态条件下土壤微生物群落的差异性,目前对于石油污染土壤堆肥(尤其是强化堆肥)中的微生物群落结构以及强化降解机制的研究还十分有限。本研究从大庆石油污染土壤中分离筛选高效石油烃降解菌群和鼠李糖脂表面活性剂产生菌,在此基础上研究不同堆肥方式(自然堆肥、表面活性剂强化堆肥和复合菌群强化堆肥)对大庆石油污染土壤中石油的降解情况,采用16s r DNA高通量测序技术检测堆肥过程中微生物群落结构,分析石油烃降解过程与微生物群落之间的关系;构建Alk B(烷烃单加氧酶)功能基因克隆文库,分析堆肥各时期烃降解功能微生物的多样性和结构变化;对Alk B基因进行荧光定量PCR检测,研究烃降解功能菌群的数量、活性特征与石油烃降解过程之间的关系,研究揭示了堆肥过程中石油降解的微生物生态学机制,为大庆油田及其他油田石油污染土壤的堆肥修复提供理论依据。论文的主要研究结果如下:(1)从大庆油田石油污染土壤与牛粪、秸秆的堆肥体系中分离筛选到耐高温石油降解菌群wt-3,通过16S r DNA鉴定,该菌群优势属为芽孢杆菌属、假单胞菌属、红球菌属、假黄单胞菌属和赖氨芽孢杆菌属。wt-3降解石油的最佳条件是:培养温度45℃、初始p H为7.0、接种量3%、摇床转数160r/min、培养基石油浓度2%,此条件下最高降解率为75.3%。柱层析分析表明,wt-3对原油组分中饱和烃、芳香烃、沥青质和胶质的降解率分别为83%、50%、25%和30%,说明该复合菌群能够有效的降解石油污染物。(2)从大庆石油污染土壤中筛选筛选到一株高产表面活性剂的菌株wk-4,经生理生化及16S r DNA鉴定确定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。该菌株的产表面活性剂的最优发酵条件为:碳源豆油10 g/L、氮源氯化铵5 g/L、发酵时间120 h时,此条件下糖脂类表面活性剂的产量可达0.81 g/L,在已有报道文献中产量较高。经薄层层析法确定该表面活性剂为糖脂类表面活性剂,硅胶柱纯化后收集得到单双鼠李糖脂两种组分。该鼠李糖脂产物临界胶束浓度为50mg/L,盐浓度耐受范围为0%-6%,p H耐受范围为3.0-12.0,适宜温度范围为20℃-100℃,可应用于堆肥处理中。在石油污染土壤的原位修复试验中,添加3CMC浓度鼠李糖脂的土壤样品降解率最高,降解率为67.4%(3)三种堆肥方式均可有效降解总石油烃(TPH),强化堆肥(表面活性剂强化堆肥和复合菌群强化堆肥)降解效率高于自然堆肥。在42天堆肥结束时自然堆肥、表面活性剂强化堆肥和复合菌群强化堆肥中TPH降解率分别为69%88%和80%,降解半衰期为23d、14d和18d。堆肥过程中,强化堆肥各时期细菌数量均明显高于自然堆肥,细菌的数量级达到109CFU/g,而自然堆肥中细菌的数量级为108CFU/g,同时,强化堆肥中高温期持续11d以上,自然堆肥中高温期仅持续7d,这表明强化堆肥均可通过促进微生物的代谢和繁殖来提高石油污染物的降解速率。TPH测定结果还表明:不同堆肥方式中烃降解的规律不同,自然堆肥中腐熟期TPH降解速度最快,表面活性剂强化堆肥中降温期TPH降解速度最快,而复合菌群强化堆肥中TPH降解最快时期出现在高温期,但三种堆肥方式中石油降解过程均符合一级反应动力学方程。GC-FID分段分析表明,两种强化堆肥可降解的原油优势组分不同,表面活性剂强化堆肥中对烷烃的降解更有利,复合菌群强化堆肥中对芳香烃类的降解更有利。(4)细菌16Sr DNA高通量测序分析表明,三种不同方式的堆肥中微生物群落丰富度和多样性变化趋势一致,即高温期微生物群落丰富度和多样性最少,进入降温期和腐熟期逐渐增加,而且在整个堆肥过程中两种强化堆肥中微生物群落丰富度和多样性均高于自然堆肥。在堆肥中降温期和腐熟期,表面活性剂强化堆肥Simpson指数分别为5.22和5.48,复合菌群强化堆肥Simpson指数分别为5.10和5.26,均高于自然堆肥(4.98和5.12)。聚类分析表明,三种方式堆肥中高温期和降温期细菌群落组成结构差异显著,而腐熟期细菌群落组成结构相似。测序结果表明三种方式堆肥中的细菌属于28个门,其中5个优势菌门为Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi、Actinobacteria。在纲水平上属于21个纲,其中9个优势纲为Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Anaerolineae、Cytophagia、Flavobacteriia和Clostridia。在属水平上对丰度前40的属统计分析,其中与石油烃降解有关的菌属有12个。自然堆肥中丰度较高的烃降解菌属为Rhodococcus sp.、Bacillus sp.和Steroidobacter sp.,显著性分析表明,TPH降解速率与Rhodococcus sp.和Steroidobacter sp.呈显著正相关(P<0.05);表面活性剂强化堆肥中丰度较高的烃降解菌为Pseudomonas sp.、Flavobacterium sp.、Pusillimonas sp.和Mycobacteriu sp.,TPH降解速率与Pseudomonas sp.和Flavobacterium sp.呈显著正相关(P<0.05),同时与Pusillimonas sp.正相关性较大;复合菌群强化堆肥中丰度较高的烃降解菌为Pseudomonas sp.、Bacillus sp.、Lysinibacillus sp.和Gordonia sp.,TPH降解速率与Pseudomonas sp.显著正相关(P<0.05),与Gordonia sp.显著负相关(P<0.05)。(5)建立了堆肥样品的Alk B基因克隆文库,共得到466条序列,分析获得12个OPFs。Alk B的α多样性分析表明,两种强化堆肥中的Alk B基因多样性均高于自然堆肥。不同堆肥方式中优势OPF不同,自然堆肥中OPF6(相似序列Rhodococcus erythropolis Alk B)和OPF2(Rhodococcus qingshengii BKS20-40 Alk B)为优势OPF,表面活性剂强化堆肥中优势OPF为OPF12(Flavobacteriales bacterium ALC-1 Alk B)和OPF8(Pseudomonas aeruginosa Alk B),复合菌群强化堆肥中OPF5(Pseudomonas sp.D86 Alk B)为优势OPF,三种堆肥方式中优势OPF的最相似菌属均与16Sr DNA高通量测序时与石油烃降解速率呈显著正相关的菌属一致。说明这些菌属作为烃降解功能微生物在堆肥的石油降解过程中发挥了主要作用。堆肥样品的Alk B基因荧光定量PCR结果显示,三种不同方式堆肥中Alk B基因拷贝数出现峰值的时间不同,各时期Alk B数量差异显著,但变化趋势与各自堆体中石油烃降解变化趋势基本一致,说明Alk B基因的定量分析可一定程度上反映石油的降解效果。