微生物发酵合成γ-氨基丁酸(GABA)的研究

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γ-氨基丁酸(GABA)广泛存在于动、植物体内,由于它具有多种生理功能,因此作为一种添加剂广泛应用于食品及饲料等领域中。从自然界中筛选出一株高产的乳酸菌用于GABA的直接发酵已经成为近年来许多研究者的研究热点。本试验旨在从黄浆水中筛选出一株高产GABA的菌株,并对其进行鉴定,驯化,优化培养,以达到高产GABA的目的,并进一步研究了谷氨酸脱羧酶(GAD)基因,具体试验结果如下:(1)经初筛、复筛,从黄浆水中筛得一株高产GABA的菌株,对其进行形态学及生理生化鉴定,并与GenBank上已提交的16SrDNA进行比对(BLAST),结果表明,其归属于乳酸杆菌(Lactobacillus)属。由MEGA6.0软件构建的系统发育树结果表明,该菌株与Lactobacillus plantarum16SrDNA序列同源性达99%,且与生理生化试验结果一致,因此,确定该野生菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),编号为Lp-Dfa301。测得其TYG发酵液中GABA产量为5.833g/L。(2)以试验确定的最佳诱变条件对原始菌株进行诱变处理:紫外照射时间90s;硫酸二乙酯(DES)体积分数为25%醇溶液,处理时间20rmin,获得一株高产突变株命名为Lp-Dfa301-49,传代后遗传性状稳定,GABA平均产量为6.899g/L,比野生菌株提高了18.28%。(3)以Lp-Dfa301-49为试验菌株,通过单因素及正交试验对培养基进行优化,得到最优条件为:底物浓度20.00g/L;葡萄糖添加量为11.00g/L、丁二酸钠添加量为5.00g/L、酵母浸粉添加量为18.00g/L、胰蛋白胨添加量为14.00g/L;10.00g/L的P3+, Mn2+, K+, Mg2+, Ca2+添加量分别为0.30、0.35、0.40、0.60、.80mL/20mL发酵液;然后在单因素试验基础上通过响应曲面法对培养条件进行优化,得到最佳培养条件为:初始pH5.90、接种量2.70%、培养时间71.00h。优化后GABA的产量增加到12.863g/L,比优化前提高了86.45%。(4)本论文还利用单因素和响应面试验对生产GABA的原料进行了摸索与优化,得到一组较优的条件组合:玉米糖化液添加量5.75mL/100mL(发酵液)、玉米粉添加量为19.90g/L、黄豆粉添加量为35.20g/L,发酵液中GABA产量为3.371g/L。为富含GABA发酵食品的研制奠定了基础,有利于资源的回收和利用。(5)最后采用PCR技术和生物信息学分析验证了Lp-Dfa301-49菌株的谷氨酸脱羧酶(GAD)基因,利用Exploring-Local Vector NTI Database软件进行拼接、同源性分析及翻译。应用生物信息学分析方法和工具对lpgadB基因蛋白质的理化性质、跨膜区、信号肽、蛋白质二级结构、三级结构等进行分析和预测,并探讨了它们的作用方式。结果表明:lpgadB蛋白为亲水性稳定蛋白;不存在信号肽及跨膜区,不属于分泌蛋白;有两个N-糖基化位点;属于AAT超家族(折1型)磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶;蛋白质三级结构分析表明以3fz6.1.A、1pmm.1.A,1xey.1.A、2dgk.1.A、3hbx.1.A为模版进行建模,覆盖率都能达92%以上,相似一致性达42.00%以上。
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