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一、研究目的:卵巢早衰（Premature Ovarian Failure,POF）是指女性在40岁之前卵巢功能提前衰退,雌激素水平下降,卵泡刺激素和黄体生成素水平上升,伴月经后期、闭经、不孕等表现的疾病。卵巢早衰的病因多且复杂,包括遗传因素、免疫因素及心理因素等,卵巢早衰低雌激素状态还会引发骨质疏松等并发症,严重影响患者的身心健康。卵巢早衰的发病率约为3%,是当今医学领域研究的热点。二仙汤是临床上常用的能有效缓解卵巢早衰症状的中药复方,二仙汤方中以仙茅、仙灵脾二药为主,故名“二仙汤”,二仙汤组成有仙茅、仙灵脾（又称淫羊藿,下文以淫羊藿代替）、巴戟天、黄柏、知母和当归,二仙汤温肾益精,调理冲任,能有效治疗卵巢早衰。氧化应激是导致机体衰老的重要原因,氧化应激是指机体的氧化系统和抗氧化系统失去平衡,倾向于氧化,为了研究二仙汤及仙茅-淫羊藿治疗卵巢早衰是否通过抗氧化发挥作用,对氧化应激的关键因子核转录因子Nrf 2及Nrf 2-ARE信号转导通路展开研究。氧化应激影响着血管生成,为了更全面的研究二仙汤及仙茅-淫羊藿治疗卵巢早衰的作用机制,同时对血管生成因子VEGF及VEGF-VEGFR2信号转导通路展开研究。本实验主要通过顺铂建立卵巢早衰大鼠模型,用二仙汤及仙茅-淫羊藿药物干预,通过观察二仙汤及仙茅-淫羊藿对POF大鼠血清性激素和抗氧化指标的影响、对POF大鼠卵巢组织氧化应激相关因子Nrf 2及其下游抗氧化因子HO-1、NQO1的影响、以及血管生成相关指标VEGF及其受体VEGFR2的影响,从分子水平来探讨二仙汤及仙茅-淫羊藿抗卵巢早衰的作用机制。二、研究方法和结果:实验一:方法:雌性SD大鼠40只,监测一周动情周期,筛选有正常动情周期的大鼠入组,随机分为4组:正常组、模型组、阳性对照组和二仙汤组。除正常组外,其余三组使用顺铂注射液造卵巢早衰模型,阳性组和二仙汤组在造模过程中灌胃给药并监测动情周期。15天后麻醉称重取材。通过卵巢组织病理学及测定血清激素水平进行疗效评估。放射免疫分析法分别测定各组大鼠血清中性激素FSH、LH、E2及氧化应激相关指标MDA、SOD、CAT水平;HE染色观察卵巢组织切片中卵泡状态和数量,评估卵巢功能。结果:与正常组相比,模型组大鼠卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）水平显著上升（P<0.01）,雌激素（E2）水平显著下降（P<0.01）。与模型组相比,二仙汤治疗后可明显降低FSH和LH水平（P<0.01或P<0.05）,上调E2水平（P<0.01）,同时也能降低POF大鼠血清中丙二醛（MDA）的含量（P<0.01）,增高抗氧化相关指标超氧化物歧化酶（SOD）过氧化氢酶（CAT）的含量（P<0.01）。光镜观察发现二仙汤能减少闭锁卵泡数量,增加窦卵泡数,有效改善大鼠卵巢组织中的卵泡状态。实验二:雌性SD大鼠40只,监测一周动情周期,筛选有正常动情周期的大鼠入组,随机分为4组:正常组、模型组、阳性对照组和二仙汤组。除正常组外,其余三组使用顺铂注射液造卵巢早衰模型,阳性组和二仙汤组在造模过程中灌胃给药并监测动情周期。15天后麻醉称重取材,蛋白印迹法测定卵巢组织中的Nrf 2、HO-1及NQO1蛋白表达;免疫组化法检测卵巢组织中的Nrf 2、HO-1及NQO1蛋白定位及含量;TUNEL法检测各组的卵巢组织细胞凋亡情况。结果:WB与IHC-P结果提示:与正常组相比,模型组大鼠的卵巢组织中Nrf 2、HO-1及NQO1蛋白含量显著下降（P<0.01）;而与模型组相比较,阳性组、二仙汤组大鼠卵巢组织中Nrf 2、HO-1及NQO1蛋白的含量显著升高（P<0.01）。TUNEL结果提示:模型组大鼠卵巢组织细胞凋亡数目较正常组明显增多,经二仙汤给药干预后,凋亡的组织细胞数量明显减少。实验三:方法:雌性SD大鼠40只,监测一周动情周期,筛选有正常动情周期的大鼠入组,随机分为4组:正常组、模型组、阳性对照组和二仙汤组。除正常组外,其余三组使用顺铂注射液造卵巢早衰模型,阳性组和二仙汤组在造模过程中灌胃给药并监测动情周期。15天后麻醉称重取材,蛋白印迹法检测卵巢组织中的VEGF及VEGFR2蛋白表达;免疫组化法检测卵巢组织中的VEGF及VEGFR2蛋白定位及含量。结果:WB与IHC-P结果提示:与正常组相比,模型组大鼠的卵巢组织中VEGF及VEGFR2蛋白的表达显著下降（P<0.01）;而与模型组相比较,阳性组、二仙汤组大鼠卵巢组织中VEGF及VEGFR2蛋白的含量与阳性表达率均显著升高（P<0.01）。结果提示二仙汤可以促进卵巢组织中VEGF及VEGFR2的表达。实验四:方法:雌性SD大鼠60只,监测一周动情周期,筛选有正常动情周期的大鼠入组,按随机数表随机分为6组:正常组、模型组、阳性对照组、仙茅组、淫羊藿组以及仙茅-淫羊藿药对组。除正常组外,其余各组采用顺铂腹腔注射建立卵巢早衰模型,阳性组和中药组在造模过程中灌胃给药并监测动情周期,15天后麻醉称重取材。通过卵巢组织病理学及测定血清激素水平进行疗效评估。放射免疫分析法分别测定各组大鼠血清中性激素FSH、LH、P、E2水平;HE染色观察卵巢组织切片中卵泡状态和数量,评估卵巢功能。结果:仙茅-淫羊藿可明显降低POF大鼠血清卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）水平,上调雌激素（E2）和孕酮（P）水平（P<0.01或P<0.05）,且根据金氏公式计算得出的相关系数q>1.15,表明仙茅和淫羊藿两药配伍能起到协同作用,对相关指标的调控作用优于单独使用。仙茅和淫羊藿能减少闭锁卵泡数量,增加窦卵泡数,改善卵巢功能。实验五:方法:雌性SD大鼠60只,监测一周动情周期,筛选有正常动情周期的大鼠入组,按随机数表随机分为6组:正常组、模型组、阳性对照组、仙茅组、淫羊藿组以及仙茅-淫羊藿药对组。除正常组外,其余各组采用顺铂腹腔注射建立卵巢早衰模型,阳性组和中药组在造模过程中灌胃给药并监测动情周期,15天后麻醉称重取材。蛋白印迹法测定卵巢组织中的Nrf 2、HO-1及NQO1蛋白表达;免疫组化法检测卵巢组织中的Nrf 2、HO-1及NQO1蛋白定位及含量;TUNEL法检测各组的卵巢组织细胞凋亡情况。结果:WB与IHC-P结果提示:与正常组相比,模型组大鼠的卵巢组织中Nrf 2、HO-1及NQO1蛋白的含量均显著下降（P<0.01）。与模型组相比较,阳性组、药对组大鼠卵巢组织中Nrf 2、HO-1及NQO1蛋白的含量显著升高（P<0.01）。Nrf 2、HO-1及NQO1三种蛋白的表达呈现出高度的正相关性。另外,与药对组相比较,仙茅组与淫羊藿组的Nrf 2、HO-1及NQO1蛋白含量显著降低（P<0.01或P<0.05）。TUNEL结果提示:模型组大鼠卵巢组织细胞凋亡数目较正常组明显增多,而经雌激素和药对组药干预后,凋亡的组织细胞数量明显减少。实验六:方法:雌性SD大鼠60只,监测一周动情周期,筛选有正常动情周期的大鼠入组,按随机数表随机分为6组:正常组、模型组、阳性对照组、仙茅组、淫羊藿组以及仙茅-淫羊藿药对组。除正常组外,其余各组采用顺铂腹腔注射建立卵巢早衰模型,阳性组和中药组在造模过程中灌胃给药并监测动情周期,15天后麻醉称重取材。蛋白印迹法测定卵巢组织中的VEGF及VEGFR2蛋白表达;免疫组化法观察卵巢组织中VEGF及VEGFR2蛋白的定位与表达。结果:WB与IHC-P结果提示:与正常组相比,模型组大鼠的卵巢组织中VEGF及VEGFR2蛋白的含量均显著下降（P<0.01）;而与模型组相比较:阳性组、药对组大鼠卵巢组织中VEGF及VEGFR2蛋白的含量显著升高（P<0.01）,仙茅组与淫羊藿组的VEGF、VEGFR2蛋白表达显著上升（P<0.05或P<0.01）。与药对组相比较,仙茅组与淫羊藿组的VEGF、VEGFR2蛋白表达显著降低（P<0.05或P<0.01）。三、研究结论1.二仙汤及核心药对仙茅-淫羊藿能够改善卵巢早衰大鼠卵巢组织中卵泡的生长发育,改善卵巢组织的结构与功能,改善卵巢早衰大鼠的内分泌,通过调节卵巢早衰大鼠的抗氧化能力来改善卵巢功能。2.二仙汤及核心药对仙茅-淫羊藿能通过调控Nrf 2-ARE信号通路,上调Nrf 2及其下游蛋白的含量,改善氧化应激状态从而治疗卵巢早衰。3.二仙汤及核心药对仙茅-淫羊藿能通过调控VEGF-VEGFR2信号通路,上调VEGF及其相关蛋白的含量,促进血管生成从而治疗卵巢早衰。4.二仙汤中的仙茅-淫羊藿配伍使用的效果明显优于单味药单独使用,说明仙茅和淫羊藿配伍能够起到协同作用。