菘蓝是常用中药板蓝根和大青叶的主要来源植物,其有效成分靛玉红是它的次生代谢产物,属于吲哚类生物碱。目前,普遍认为植物次生代谢物的产生和积累会在植物遭受到逆境胁迫时增加。作为次生代谢产物的靛玉红在菘蓝体内的生成与积累理论上也应当遵循这一规律,这种现象的存在必然与菘蓝在逆境时体内许多的生理生化反应有关,与菘蓝抵御和适应逆境胁迫的分子机制有关,这其中必定存在着一定的分子基础。 探讨和研究这些规律,对于我们深入了解菘蓝的习性、.耐逆机制和体内有效成分的积累很有帮助,能够指导我们科学合理的栽培菘蓝,获得产量更高、质量更好的板蓝根原料,为人们防病治病提供更加物美价廉的药材,同时也能为植物次生代谢规律和耐逆分子机制的研究提供一些理论基础。 本实验以菘蓝无菌幼苗为材料,分析了靛玉红在经过不同逆境胁迫处理的菘蓝幼苗体内的变化规律,克隆得到了一个耐逆相关基因:IiLEA基因,并采用NOrthern杂交初步分析了该基因在菘蓝幼苗体内的表达规律。主要实验方法和结论如下: 1.将培养30天的菘蓝无菌幼苗分别用250mmol/LNaCl、自然干旱、20mmol/LABA、4℃低温处理,不同时间内取样,采用高效液相色谱法对其中靛玉红的含量进行了测定。结果表明:盐、干旱、ABA处理12h内能提高菘蓝幼苗中靛玉红含量59.05%～161.67%,低温胁迫处理24h也能提高靛玉红含量141.4%,说明适当逆境胁迫处理能有效提高菘蓝幼苗体内靛玉红的累积,其中250mmol/L盐胁迫处理效果更为显著。 2.以250mmol/LNaCl溶液胁迫处理9h的菘蓝无菌幼苗为材料,根据Genbank数据库中已公布的几种植物第3组LEA基因同源序列设计引物,采用RT-PCR法成功克隆出菘蓝的LEA基因,测序结果表明该基因序列全长693bp,含有一个648bp的开放阅读框和45bp的3’-非编码区,编码一个由215个氨基酸组成的亲水性蛋白质,分子量23kDa,等电点为8.07,具有7个第3组LEA蛋白所特有的11氨基酸组成的基元重复序列,预测的二级结构有50%以上的α-螺旋及2个PFAM LEA结构域。将该基因命名为IiLEA基因,在Genbank中的注册号为:AY866484。 3.为了检测IiLEA基因在菘蓝幼苗体内的表达模式,本研究以生长30天的菘蓝无菌幼苗为材料,分别用250mmol/L NaCl溶液的盐胁迫法和自然干旱胁迫法对其