研究背景大脑是一个高度分布式系统，不同感知信息在大脑的不同脑区得到处理和并行执行，但并没有一个统一的协调中心负责管理不同脑区功能的协调。大脑的同步振荡活动被认为是捆绑一些空间上分隔，但又彼此相关的神经信息的机制之一，可协助大脑实现多脑区的协同工作。目前普遍认为神经元共振是神经网络振荡活动的重要基础。现已发现皮层和海马等部位神经元均存在共振现象，并证实这些细胞的共振参与了振荡节律的形成，具有重要生理功能。但对基底节（BG）各核团神经元共振特性的研究还处于空白状态，研究BG各核团神经元的共振及其机制，有可能帮助我们深入认识BG系统调节运动功能的电生理机制。帕金森病（PD）等病理条件下，BG的异常同步振荡可通过神经投射通路影响大脑皮层，导致皮层感觉运动区活动异常，从而错误地捆绑了多脑区的运动信息，造成本该协同工作的肌肉群发生紊乱，导致相应的临床症状。目前，BG-皮层环路的异常同步振荡已成为PD的新病理机制，但发生异常振荡的机理仍不清。神经元共振是神经网络振荡活动的重要基础，故研究BG各核团神经元的共振现象及其和PD的关系意义重大，有可能在PD发生的电生理机制方面有所突破。丘脑底核（STN）在PD的形成发展过程中起了重要作用，是临床DBS治疗PD的主要靶核之一。目前已证实黑质致密部和STN间存在直接的多巴胺能纤维联系，多巴胺可通过STN神经元表面的多巴胺受体直接作用于其神经元。故本课题首先选取STN作为研究对象，研究其共振现象及机制，并深入研究该神经元共振和多巴胺受体的关系。实验目的（1）研究STN神经元是否有共振现象并研究其常规特性；（2）探索STN神经元共振的离子机制；（3）分别研究多巴胺D1、D2受体阻断剂对STN神经元共振特性的影响及其和超极化激活的阳离子流（Ih）的关系；（4）初步探索多巴胺受体阻断剂影响STN神经元共振的信号转导途径。实验方法（1）脑片准备及钳制细胞异氟烷吸入麻醉后断头处死大鼠（13-18天，雄性），迅速取脑，置于予充混合氧（95%O₂，5%CO₂）的冰浴人工脑脊液（ACSF）中，振动切片机切取含STN的脑片（350-400μm），在ACSF中孵育（34℃）1小时，以恢复脑片状态，将脑片移至记录浴槽，用氧饱和的ACSF持续灌流（2ml/min）。开启浴槽加热系统，使脑片温度维持在34℃。镜下定位核团并选取活性较好的细胞，常规钳制细胞形成全细胞模式，所用玻璃微电极电阻3-7MΩ。让细胞恢复约5分钟后，利用细胞的电生理特征鉴定细胞并测试细胞膜电位、动作电位等常规参数，选择串联电阻在10-20MΩ，静息电位负于-55mV，同时动作电位超射较好的神经元进行实验。（2）神经元共振特性测试在全细胞电流钳模式下，先用直流电将细胞钳制于目标电压（-50mV，-60mV，-70mV，-80mV及-90mV），通过记录电极给予细胞一个振幅固定、频率随时间线性增大的正弦电流（ZAP）刺激，记录神经元的电压反应。共振表现为神经元膜电压在某个特定的频段出现一个可重复的凸起共振峰，共振峰所对应的频率即为细胞的共振频率(f_res)。为了量化共振的强度，将共振峰的阻抗值与0.5Hz对应的阻抗值的比值作为衡量共振强度的指标，称为Q值。调整ZAP电流强度使其引起的电压反应峰峰值控制在±10mV以内，以免诱发动作电位，必要时可适当使用河豚毒素（TTX）。为了方便测量f_res及Q值，将记录到的电压反应和输入的ZAP电流进行快速傅立叶变换（FFT），计算阻抗值（Z），公式为： Z=FFT（V）/FFT（I），绘制阻抗曲线，在阻抗曲线上很容易读出f_res并计算出Q值。为了排除刺激的时间依赖性对细胞共振峰的影响，给予反向ZAP电流（时程20s，频率18-0Hz）刺激，观察细胞的电压反应与正常ZAP刺激结果是否一致。（3）神经元放电的频率选择性测试在全细胞电流钳模式下，先用直流电将细胞钳制于目标电压（-70mV），通过调节增益水平逐渐加大ZAP电流的幅度，直至刚刚出现动作电位，观察细胞放电所对应的频段。为了排除放电的时间及波形依赖性，换一种刺激方式，给予不同频率的等幅恒频的正弦电流刺激，同法观察细胞的优先放电频率。（4）神经元I_h的记录钳制细胞形成全细胞模式并待细胞状态稳定后，在全细胞电压钳模式下，给予一串超极化step电压刺激，记录膜电流，I_h表现为一缓慢激活的内向电流。（5）Ih在STN神经元阈下共振及放电频率选择性中的作用在外液中给予I_h特异性阻断剂ZD7288（20μM），观察给药前后STN神经元阈下共振及放电频率选择性的变化。（6）不同多巴胺受体阻断剂对STN神经元共振的影响①分别给予氯氮平（Clozapine，50μM）、氟哌啶醇（Haloperidol，30μM）、SCH-23390（1μM）、舒必利（Sulpiride，1μM）等不同亚型多巴胺受体的阻断剂，观察给药前后STN神经元共振特性的变化，研究其对STN神经元共振特性的影响。②前面实验证实D2受体特异性阻断剂Sulpiride可阻断STN神经元的共振现象，但D1受体特异性阻断剂SCH-23390对共振无显著影响。故我们进一步研究Sulpiride对Ih的影响，探索其影响共振的离子机制，并研究其对STN神经元放电频率选择性的影响。（7）Sulpiride影响STN神经元的信号转导途径初探①按下表分组、加药（n=10）②主要观察指标有：神经元阈下共振特性、神经元放电的频率选择性。钳制细胞形成全细胞模式后等20min左右，待GDP-β-S、GTP-γ-S、GTP等药物扩散至细胞内、有效作用于细胞后再开始实验，方法同前。（8）所记录神经元的定位及形态学观察随机抽取部分神经元（15个）行荧光黄标记染色，用含荧光黄的电极内液（1.5‰）在避光条件下钳制细胞，常规行电生理记录，留置电极30min以上，荧光光源下观察神经元形态，确认染色充分后，缓慢退出电极。将脑片切掉一角并记录，以标记正反面，在4%多聚甲醛中避光固定。将甲醛固定过的脑片铺于载玻片上，有标记细胞的一面朝上，荧光封片液、指甲油封片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。（9）统计学处理采用SPSS13.0进行分析，实验结果用均值±标准差（x±SD）表示。各组间的数据用One-way ANOVA或Two-way ANOVA进行比较，两两之间用LSD方法进行比较，两组间均数的比较采用t检验，如P <0.05则认为有统计学差异。实验结果（1）STN神经元的形态学定位及电生理鉴定激光共聚焦显微镜下观察荧光黄标记的STN神经元，低倍镜下证实实验所选细胞均位于STN，高倍镜下可见神经元胞体、轴突清晰可见，形态符合STN神经元特征。电压钳下给予一串超极化Step电压刺激，可见明显Ih及尾电流。电流钳下给予一串外向电流刺激，使细胞超极化，记录细胞的电压反应，其主要特征有刺激起始段的Sag、刺激末伴随动作电位的反跳去极化及动作电位后的平台电位，符合STN神经元的电生理特性。（2）STN神经元的阈下膜共振在34℃条件下，将细胞钳制于-70mV水平，给予ZAP电流刺激，记录到的电压反应呈梭形，在2.5-3Hz频段，电压反应显著增强，证实细胞存在共振现象。将数据做快速傅立叶变换，绘制阻抗曲线，可见该细胞fres亦在2.5-3Hz频段。统计分析示神经元共振的fres和Q值分别为2.67±0.29Hz和1.093±0.0202（n=8）。反向ZAP电流刺激产生的电压反应较上述结果无明显差异（P>0.05, n=6）。（3）STN神经元共振的温度依赖性将细胞钳制于-70mV水平，在30℃、34℃、38℃三个不同温度水平观察STN神经元的共振特性。神经元fres随温度升高而升高，统计数据示：神经元fres在30℃、34℃、38℃条件下分别为1.99±0.36Hz、2.67±0.29Hz、4.07±0.40Hz，经单因素方差分析统计三组间统计学差异显著（P <0.05，n=8）。（4）STN神经元共振的电压依赖性在-60mV到-90mV水平神经元对ZAP电流的电压反应呈梭形，共振明显。fres随电压的超极化而升高，可从-60mV时的2.01±0.25Hz升高到-90mV时的3.09±0.32Hz，经方差分析统计各组间统计学差异显著（P <0.05，n=10）。Q值亦有显著电压依赖性，-60mV、-90mV时其水平较低，-70mV条件下Q值最大，达1.092±0.021。-50mV条件下神经元对ZAP电流的电压反应呈喇叭口状，无明显共振现象。（5）STN神经元放电的频率选择性给予ZAP电流证实STN神经元存在阈下共振后，逐渐加大ZAP电流的幅度，直至刚刚出现动作电位，发现细胞最先出现放电的频段和其fres一致。换一种刺激方式，给予不同频率的等幅恒频的正弦电流刺激，结果亦证实细胞最先出现放电的频段与fres一致。（6）抑制Ih可阻断STN神经元的阈下共振及其放电频率选择性在全细胞电压钳模式下， Ih表现为一缓慢激活的内向电流，在各电位水平均可被ZD7288显著抑制（P <0.05，n=12）。生理条件下神经元存在共振现象，放电的频率选择性明显，给予ZD7288阻断Ih后，记录的电压反应变为喇叭口状，共振消失、神经元放电的频率选择性也同时消失。统计分析显示ZD7288消除共振及放电频率选择性的有效率均可达100%（n=10）。（7）多巴胺受体阻断剂对STN神经元阈下共振的影响外液中加入Clozapine （50μM）或Haloperidol （30μM）同时阻断D1、D2受体后，神经元对ZAP的电压反应呈喇叭口状，共振现象被消除。外液中加入Sulpiride单纯阻断D2受体效果类似。统计分析显示Clozapine、Haloperidol及Sulpiride消除共振的有效率均可达100%（n=10）。外液中加入SCH-23390单纯阻断D1受体，STN神经元阈下共振未见明显改变（P>0.05，n=10）。（8）Sulpiride对STN神经元放电频率选择性的影响在34℃、-70mV条件下，给药前，细胞最先出现放电的频段与细胞的fres一致。外液中加入Sulpiride （1μM）阻断D2受体后，细胞在最低频率处首先出现放电，与ZD7288的效果类似。更换刺激方式为不同频率的等幅恒频的正弦电流刺激，结果类似。上述两种方法均证实Sulpiride阻断STN神经元放电频率选择性的有效率达100%（n=10）。（9）Sulpiride对STN神经元Ih的影响给予Sulpiride （1μM）阻断D2受体，各电位水平的Ih均被显著抑制（P<0.05,n=10），与ZD7288效果类似。（10）Sulpiride通过G蛋白偶联受体影响STN神经元共振及其放电频率选择性正常对照组神经元对ZAP电流的电压反应呈梭形，共振现象明显，在其fres附近频段最易出现放电，内液中加入GDP-β-S阻断G蛋白偶联受体（GPCRs）可模拟Sulpiride的作用，神经元共振、放电频率选择性均被抑制。内液中加入GTP-γ-S激动GPCRs后，可阻断Sulpiride的作用。统计分析显示：Sulpiride、GDP-β-S完全消除共振的有效率均达100%（n=10），GTP-γ-S阻断Sulpiride作用的有效率亦达100%（n=10）。该结果提示，Sulpiride通过阻断多巴胺对GPCRs的作用实现其对STN神经元共振的影响。结论（1）STN神经元存在共振现象，该现象具有温度依赖性及电压依赖性；（2）Ih介导了STN神经元的共振；（3）D2受体特异性阻断剂（Sulpiride）可阻断STN神经元的共振现象，但D1受体特异性阻断剂（SCH-23390）对上述共振现象无显著影响；（4）Sulpiride通过抑制Ih阻断STN神经元的共振现象；（5）Sulpiride通过阻断多巴胺对GPCRs的作用实现其对STN神经元共振的影响。