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大豆异黄酮因其对人类和植物具有重要的生理功能而备受关注。异黄酮的合成途径中各关键酶基因协同作用共同调控异黄酮的合成，由于关键酶基因作用的复杂性使转录因子类调节基因的研究越来越多，尤其是MYB类转录因子基因被证明广泛参与异黄酮合成的调控。本文选用以鲁黑豆2号（高异黄酮品种）×南汇早黑豆（低异黄酮品种）为亲本构建的包含200个家系的重组自交系群体（RIL，F5:7-8）为材料，结合四个环境下的异黄酮含量数据和已构建的高密度遗传连锁图谱信息，采用生物信息学分析方法，鉴定在多环境条件下与异黄酮主要组分相关QTL和分析其分子生物学信息；从中挖掘出一个在多环境下与多种异黄酮组分相关的重要QTL标记区间，通过与参考基因组比对，将该区间内4个转录因子的编码基因在双亲中进行同源克隆，并测序分析，发现两个转录因子基因在亲本间存在单核苷酸多态性差异（SNP），并导致氨基酸的改变；通过设dCAPS引物，在RIL群体和自然群体中研究了两个基因SNP与异黄酮组分之间的连锁关系；采用实时定量PCR方法，检测两个转录因子基因和关键酶基因在种子发育过程中的时空表达变化，探索这两个基因与异黄酮合成途径的相关性。通过构建针对两个基因的RNAi植物表达载体，采用发根农杆菌转化大豆，以期验证两个基因在异黄酮合成中的调控作用。其主要研究结论如下：1．异黄酮主要组分相关的QTL定位与分子生物信息分析本文以110个RIL群体为材料，基于高密度的遗传连锁图谱，采用ICIMapping和QTXNetwork两个软件定位与异黄酮主要组分相关的QTL。其中，利用ICIMapping的ICIM和IM方法在四个环境下共定位到43个加性QTL，其表型遗传解释率为3.68%-44.98%。其中有8个区间在多个环境下均被检测到，更有2个标记区间位于前人定位到的异黄酮QTL区间内。利用QTXNetwork软件共检测到127个加性QTL和31对上位性QTL，其中11个加性QTL同时被ICIM和IM方法检测到，4个加性QTL涉及上位性的形成；另有55对加性QTL和7对上位性QTL被检测到与环境具有显著的互作效应。通过生物信息学方法，对QTL区间内的基因进行了分析，发现6类与异黄酮相关的关键酶结构基因，另有MYB和锌指蛋白两类转录因子基因，其中已被证明对异黄酮合成具有调控作用的MYB基因GmMYB176位于5号染色体标记区间M282372-M248106内。标记区间M953037-M941848在多环境下被检测到与多种异黄酮组分相关，是本项研究新发现的重要QTL。2．大豆转录因子的克隆与群体验证通过与参考基因组比对，对标记区间M953037-M941848内的基因进行分析，该区间内共有93个注释基因，其中包含3个MYB类转录因子和1个锌指蛋白类转录因子基因。采用同源克隆的方法，将所有转录因子基因克隆和测序，发现两个在大豆品种鲁黑豆2号和南汇早黑豆中存在差异的基因，分别是MYB类转录因子Gm20MYB-1和锌指蛋白类转录因子基因Gm20ZF-1。Gm20MYB-1在双亲中有一个SNP（T/C）的变异，引起组氨酸和精氨酸编码的变化；Gm20ZF-1在双亲中发现两个SNP差异，分别为SNP（A/G）和SNP（C/T），相应引起编码氨基酸的变化和编码的提前终止。利用4对dCAPS引物对三个SNP在RIL群体和自然群体中的表现进行检测，结合四个环境下的异黄酮含量数据进行方差分析和关联分析。结果显示在RIL群体中除黄豆黄苷（Glycitin，GL）、丙二酰基黄豆黄苷（Malonylglycitin，MGL）和黄豆黄素（Glycitein，GLE）三种黄豆黄苷类组分外的其余异黄酮组分含量在三个SNP变异下差异显著；而在自然群体中，仅有黄豆苷（Daidzin，D）和三种黄豆黄苷类组分（GL，MGL，GLE）含量在Gm20ZF-1的两个SNP变异下差异显著。自然群体TASSEL关联分析中未发现异黄酮含量与三个SNP的显著相关性。3．大豆转录因子基因Gm20MYB-1和Gm20ZF-1的时空表达分析以鲁黑豆2号和南汇早黑豆开花后30天、40天、50天和60天的未成熟种子为材料，采用real-timePCR方法分析Gm20MYB-1和Gm20ZF-1在种子成熟过程中的表达变化趋势。在发育的大豆种子中异黄酮组分积累逐渐增加，且Gm20MYB-1的表达量也随种子的发育逐渐升高，与异黄酮积累趋势一致；而Gm20ZF-1在种子发育过程中的相对表达量变化与异黄酮的积累无明显的相关性。Gm20MYB-1在花、茎、叶、根、种子中相对表达量变化为：种子>叶>茎>花>根；Gm20ZF-1在花、茎、叶、根、种子中相对表达量变化为：种子>根>叶>花>茎。同样我们也检测了异黄酮种子发育过程中各关键酶基因的表达变化，发现CHS7、CHS8、CHR、CHI1A、IFS2在鲁黑豆2号和南汇早黑豆中表达趋势相同，都随种子发育其相对表达量逐渐上升，这种趋势与Gm20MYB-1的表达趋势相一致。4．大豆转录因子基因Gm20MYB-1和Gm20ZF-1的RNAi载体构建为进一步验证Gm20MYB-1和Gm20ZF-1对大豆异黄酮合成的调控作用，我们分别构建了针对这两个基因的RNAi载体。采用内含子间隔的反向互补片段插入带有组成型启动子CaMV35S的植物表达载体pGFPGUSplus中，最终成功构建了pGFPGUSplus-Gm20MYB-1-RNAi和pGFPGUSplus-Gm20ZF-1-RNAi载体，转入发根农杆菌K599感受态细胞中，进行大豆子叶节的遗传转化，并进行阳性发根的异黄酮含量检测。结果表明转Gm20ZF-1-RNAi基因的发状根中异黄酮含量显著下降，表明Gm20ZF-1与大豆异黄酮的积累有关。