阿拉伯木聚糖溶解、降解机制的研究及酸性木聚糖酶基因的克隆、表达

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大麦中的非淀粉多糖主要由阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖组成,在过去的40多年,β-葡聚糖在制麦和酿造过程中的作用已得到研究者广泛而深入的了解,但对阿拉伯木聚糖的研究确却很少。最近研究者开始发现来源于谷物中的阿拉伯木聚糖会造成浸出率降低、麦汁粘度升高、过滤速度减慢、缩短滤膜寿命,甚至造成成品啤酒的浑浊。本文在研究了阿拉伯木聚糖测定方法的基础上,调研了市售啤酒和啤酒用大麦中阿拉伯木聚糖的含量。系统的研究了糖化参数对阿拉伯木聚糖溶解的影响,运用数学模型预测糖化醪中阿拉伯木聚糖浓度,并通过电子显微镜观察了不同分子量的阿拉伯木聚糖对膜孔堵塞的情况。为了实现对酿造中阿拉伯木聚糖的酶法降解,对一株能产酸性木聚糖酶的真菌Aspergillussp.ZH-26进行鉴定后,优化其产木聚糖酶的发酵条件和培养基组成,并尝试了将Aspergillussp.ZH-26酸性木聚糖酶基因在大肠杆菌中进行克隆和表达。 本文通过建立糖腈乙酰化气相色谱法测定啤酒(麦汁)中的阿拉伯木聚糖,测定了36种市售啤酒中阿拉伯木聚糖的含量在479~1239mg/L,多聚阿拉伯木聚糖的含量在283~849mg/L。测定了36种国产主要啤用大麦中总阿拉伯木聚糖含量在3.50%~5.38%,而水溶性阿拉伯木聚糖含量在0.31%~0.67%。利用化学统计学的方法研究了啤酒中阿拉伯木聚糖、多聚阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖的含量与啤酒原麦汁浓度、粘度、浊度之间的关系。结论如下:阿拉伯木聚糖和多聚阿拉伯木聚糖与粘度的相关系数分别为0.766和0.736,都要高于β-葡聚糖与粘度的相关系数0.673。啤酒中阿拉伯木聚糖的含量显著受原麦汁浓度的影响。 系统研究了酿造过程中阿拉伯木聚糖的溶解变化,及糖化温度、谷物粉碎细度和机械搅拌等糖化参数对阿拉伯木聚糖溶解的影响。为了满足广大啤酒公司以小麦或小麦芽为辅料降低生产成本的需求,我们采用不同的辅料比、料水比和粉碎细度,在不同的糖化温度下,研究了阿拉伯木聚糖的溶解对麦汁浸出率、麦汁粘度和麦汁过滤的影响。结果如下:麦汁和啤酒中的阿拉伯木聚糖主要来源于谷物中水溶性的阿拉伯木聚糖,以大米为辅料时会降低麦汁和啤酒中阿拉伯木聚糖的含量,采用小麦或小麦芽代替辅料和代替麦芽时,随辅料比的增加,阿拉伯木聚糖的含量增加,从而增加麦汁粘度,阻碍麦汁过滤。麦汁粘度受麦汁中水溶性阿拉伯木聚糖含量的影响要高于麦汁中β-葡聚糖含量对麦汁粘度的影响。糖化温度能够促进麦芽中水溶性阿拉伯木聚糖的浸出,不溶性的阿拉伯木聚糖在高温作用下能够转变为热水可溶性的阿拉伯木聚糖。糖化机械搅拌显著影响麦芽中阿拉伯木聚糖的溶解。 通过构建热力学和动力学方程,配合计算机模拟,建立了能够模拟糖化过程中阿拉伯木聚糖的溶解和降解及麦芽内源内切木聚糖酶随机进攻的数学模型,在给定不同的糖化曲线和初始麦芽条件的情况下能预测出最终糖化麦汁中阿拉伯木聚糖的浓度。在实验室规模对此模型进行验证,说明此模型能较准确的预测糖化麦汁中阿拉伯木聚糖的浓度。进一步将此模型在两家啤酒公司进行验证,模型误差分别为16.8%和17.9%,说明此模型也能较为准确的反应实际生产的真实情况,为企业预测阿拉伯木聚糖的风险问题和实现对糖化过程中阿拉伯木聚糖的在线检测、控制提供了研究基础。仿真实验说明,通过在计算机上运行Matlab程序,运用建立的模型,我们可以快捷简便的对糖化过程中阿拉伯木聚糖的溶解和降解进行预测研究。 为了研究阿拉伯木聚糖是否会对微孔滤膜产生堵塞,通过对小麦中阿拉伯木聚糖的分离、纯化,得到分子量为102kDa、282kDa、389kDa和963kDa的阿拉伯木聚糖,并建立了评价阿拉伯木聚糖影响膜堵塞的评价体系。通过建立多元回归方程发现,对于未经剪切力作用的啤酒,研究发现F>0.22比F>0.45更容易受到阿拉伯木聚糖浓度的影响。经剪切力作用的啤酒与未经剪切力作用的啤酒相比,阿拉伯木聚糖的粒径大小在剪切力作用下会显著增加,而且被0.45μm膜截留的那部分阿拉伯木聚糖的比例显著增加。高分子量的阿拉伯木聚糖在0.45μm和0.22μm膜上的粒径分布与剪切力和乙醇浓度呈正相关。与0.22μm膜相比,被0.45μm膜截留的那部分阿拉伯木聚糖更容易受乙醇浓度的影响,但不受pH值的影响。通过采用电子显微镜(SEM)手段,表征了阿拉伯木聚糖能够堵塞啤酒的膜过滤,并且随阿拉伯木聚糖分子量的增加膜堵塞情况更加严重。 阿拉伯木聚糖的酶解定量问题是一直困扰着酿造者开展木聚糖酶降解阿拉伯木聚糖研究的一大难题,过去所有的研究报道只是建立在利用粘度作为评价指标。我们通过提出多聚阿拉伯木聚糖(PAX)的概念用以指示高分子量部分的阿拉伯木聚糖,并被美国酿造学会采纳,解决了阿拉伯木聚糖的酶解定量难题。通过在全麦芽和以40%小麦芽为辅料的糖化初始掭加木聚糖酶,说明添加木聚糖酶能更多的溶解谷物中的阿拉伯木聚糖,使糖化醪中阿拉伯木聚糖含量升高,但能对PAX进行有效的降解,从而使经酶解后的小麦芽麦汁的粘度与全麦芽麦汁达到相当的水平,减轻糖化过滤困难的问题。进而利用响应面分析法,确定了糖化过程降解PAX的最优条件为:木聚糖酶加酶量38U/g,糖化初始pH5.5,Ca2+离子浓度为114mg/L。验证实验证明,对不同比例的小麦芽为辅料进行糖化,在优化条件下加酶后麦汁粘度都能降低到1.44cP左右的水平,说明采用较高比例的小麦芽糖化时通过外加木聚糖酶的方法能够消除阿拉伯木聚糖对麦汁粘度升高、影响过滤的问题。 为了实现对阿拉伯木聚糖的酶法降解,从一株分离得到的能产生酸性木聚糖酶的真菌Aspergillussp.ZH-26出发,通过对其形态特征和ITS保守区进行测序,对该菌进行鉴定,并在GenBank上申请登记,登记号为DQ235784。通过单因素实验对AspergillusawamoriZH-26产木聚糖酶的发酵条件进行研究,确定为:发酵初始pH4.0,30℃培养96h,装液量为30%,摇瓶转速为150r/min,接种量为1×106孢子/mL。通过Plackett-Burman多因素实验设计法,对影响AspergillusawamoriZH-26产木聚糖酶的培养基组成进行了筛选,所选取的17个影响因素为:酵母膏、胰蛋白胨、尿素、NH4C1、(NH4)2SO4、NaNO3、KH2PO4、K2HPO4、NH4NO3、MgSO4、CaCl2、CuSO4、ZnCl2、FeSO4、MnSO4、维生素B1、EDTA。方差分析表明,影响AspergillusawamoriZH-26产木聚糖酶的主要因素为酵母膏、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4、CaCl2。进一步通过响应面分析法和典型性分析得出培养基最优条件:酵母膏5.95g/L、胰蛋白胨6.79g/L、(NH4)2SO413.37g/L、KH2PO41.14g/L和CaCl20.81g/L,预测木聚糖酶最大酶活Ymax=46.90U/mL。验证性实验证明在优化条件下,AspergillusawamoriZH-26产木聚糖酶达47.26U/mL。 为了更好的研究酸性木聚糖酶的性质,以实现其潜在的工业化应用前景,我们从分子水平对其进行了研究。利用overlap-PCR技术,成功的克隆到了去除内含子的AspergillusawamoriZH-26酸性木聚糖酶(xynA)cDNA结构基因,将其接入到表达载体pTrc99a,成功构建表达载体pTrc99a-xynA。重组菌在IPTG诱导下表达出有活性的重组酶,重组酶活力平均为0.20U/mL。将重组酶按5U/g的加酶量添加到协定糖化中,以研究重组木聚糖酶对麦汁中阿拉伯木聚糖的降解。结果显示,重组酸性木聚糖酶比Shearzyme木聚糖酶更能对小麦芽中的阿拉伯木聚糖具有选择性溶解作用,且都能有效的降解麦汁中的PAX,降低麦汁粘度。
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