背景1.早期有部分研究者采用平板法,但是平板法目前使用的人较少,因为其配置琼脂溶液、铺琼脂板等过程较长且只能比较活性强弱,不能定量分析其面积,存在较大误差,APTT、PT试剂盒法经常应用于抗凝血活性测定中,但由于实验中用到血液,非常不稳定,而且血液保存和取用也给实验带来不便,所以目前大多采用药典中使用的凝血酶滴定法,该方法简便、快速,较多使用,但其存在人为误差,所以有待进一步研究。2.酶解提取仿照人体生理过程,近年来在食品、农业、医药等领域已经有应用,且现代药理研究表明,动物类药材发挥作用的主要为其小肽类成分,笔者拟采用酶解方法得到其小肽类成分,故对酶解提取工艺进行了研究。目的1.该实验拟对测定宽体金线蛭抗凝血活性的凝血酶滴定法的影响因素进行分析,同时应用于疏血通注射液的抗凝活性测定中,提升了该法测定抗凝活性的准确性。2.筛选出酶解法的较优工艺,为今后抗凝小肽物质的分离奠定基础。方法1.对目前常用的几种抗凝血测定方法进行初步实验,选择凝血酶滴定法研究的因素、宽体金线蛭的提取方法,用白瓷点滴板代替试管进行滴定反应(简称白瓷板法),考察白瓷板法和常规的试管法、不同凝血酶滴定间隔时间和凝血酶浓度对抗凝血活性测定的影响;用考察所得的方法应用于疏血通注射液的活性测定中。2.利用单因素分析得到考察的因素和水平,利用正交试验优化酶解法工艺。结果1.在同样条件下,白瓷板法测定抗凝血活性的精确度和稳定性较试管法高。用白瓷板法测定,宽体金线蛭样品浓度在一定范围内(0.125～0.333 g/ml)、凝血酶浓度为20 u/ml或10 u/ml时,每隔1 min滴加一次,每次5μL,样品浓度与消耗的凝血酶体积呈线性相关,r值分别为0.961和0.992;所测得样品的抗凝血活性分别为33.08±2.64和31.24±1.32 u/g,RSD分别为8.0%和4.2%;对于0.333g/ml浓度的样品,其测量产生的理论误差不大于10%和5%。2.疏血通注射液原液与生理盐水消耗凝血酶活性单位无明显差别,但浓缩至0.71～1.11 g/ml有明显活性,且测定结果较为稳定,其抗凝活性值稳定在 3.83～4.23 u/g。3.仿生酶解的活性成分保留较多,较优的工艺为温度39℃,pH 1.5,加酶量为300U/g,提取时间240min。可在下面的分离活性成分中使用该提取方法。结论1.白瓷板法可用于测定宽体金线蛭样品的抗凝血活性,用10u/ml的浓度的凝血酶溶液,每分钟滴加一次,每次5 μL进行测定,其线性和精确度均较好。疏血通注射液在一定浓度范围内比较适宜改良的凝血酶滴定法,在该浓度范围内,疏血通注射液的活性稳定且显著,这个活性值可用于以后的质量检测。2.仿生酶解的活性成分保留较多,较优的工艺为温度39℃,pH 1.5,加酶量为300U/g,提取时间240min。可在以后的分离活性成分中使用该提取方法。