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植物在生长过程中经常会受到环境因子的胁迫,其中高温胁迫是影响植物生长的主要环境因子之一。在高温下,植物生长发育迟缓,严重时会导致产量降低,品质下降。本论文在筛选拟南芥突变体的过程中,发现点突变体atcpr5对热敏感。于是克隆了CPR5基因(AtCPR5)并构建了相应的表达载体,对其耐热功能进行了详细的研究,主要研究结果如下:
(1)表达载体的构建与转基因植株的获得:首先我们克隆了AtCPR5(At5g64930)的全长cDNA序列,并将其插入到具有组成CaMV35S启动子的双元植物表达载体pCanG上,形成pCanG-AtCPR5的重组质粒。然后采用农杆菌花浸染法将重组质粒转化到CPR5点突变的拟南芥突变体(atcpr5)中。经卡那霉素筛选和PCR检测证明已得到35S-AtCPR5互补表达的转基因植株。
(2)热胁迫下野生型、atcpr5、35S-AtCPR5转基因植株的表型鉴定:对三种材料进行了下胚轴延伸、整个植株以及花期的耐热性鉴定实验,结果表明,35S-AtCPR5植株最耐热,atcpr5植株对热最敏感。
(3)热胁迫下叶绿素荧光测定:对三种材料进行了叶绿素荧光参数Fv/Fm、NPQ、ETR的测定,结果表明三种材料的叶绿素荧光参数随时间的延长均呈下降趋势,其中35S-AtCPR5和野生型下降速度缓慢,说明光合作用抑制较小;突变体下降速度快,说明光合作用抑制大;同时用Fv/Fm荧光成像进一步证明了这一结果。
(4)热胁迫下氧化损伤参数和抗氧化酶活性的测定:对三种材料进行了相对电导率、丙二醛(MDA)含量的测定。结果表明,与未处理样品相比,三种材料的相对电导率大小都增加,其中35S-AtCPR5植株增加较少,说明质膜渗透性较小,而atcpr5植株显著增加,说明质膜透性大;三种材料的丙二醛含量与未处理样品相比也都呈上升趋势,其中35S-AtCPR5植株上升幅度较小,说明膜脂过氧化程度较低,而atcpr5植株呈显著上升趋势,说明膜脂过氧化程度严重。DAB组织化学染色的结果进一步表明,35S-AtCPR5植株叶片染色程度较浅,说明积累的H2O2较少;atcpr5染色程度较深,说明积累的H2O2较多。同时,我们测定了相关抗氧化酶SOD、CAT、APX的活性。结果表明,35S-AtCPR5转基因植株的抗氧化酶活性较高,说明具有较强的清除活性氧能力,而atcpr5植株的抗氧化酶活性较低,说明清除活性氧的能力弱。
(5)热胁迫下热激基因的表达:采用半定量RT-PCR法,检测了野生型、atcpr5、35S-AtCPR5中热激基因HSF4、hsp101、hsp17.6、hsp70B、hsp90.1表达量的变化,结果表明,随着热胁迫时间的延长三种材料的各种热激基因的表达量均不断增加,其中在35S-AtCPR5转基因植株中的表达量最高,atcpr5的表达量最低。同时在各种热激基因中,表达量变化最显著的是hsp17.6,其次是HSF4和hsp101,hsp70B和hsp90.1差异不明显。初步推测在热胁迫条件下,AtCPR5基因可能是通过调控热激蛋白和热激转录因子,特别是hsp17.6的表达而间接提高了拟南芥的耐热性。