目的:　　1.基于席夫碱(PAS)的原理，合成了一系列具有荧光的酰肼类化合物。这些荧光化合物通过分子结构上的肼基官能团，可特异性地检测混合蛋白中的糖蛋白。　　2.在糖蛋白检测领域现有的基础上，进一步的提高检测灵敏度，缩短检测时间，降低检测成本。开发一种更加优良、稳定和实用的糖蛋白专属检测方法，更好地服务于糖蛋白组学领域的研究人员。　　方法:　　1.根据有机化学理论和文献的指导，含醛基的化合物在常温下极易与含肼基的化合物发生反应，生成相应的腙、亚胺、酰胺脲等化合物。我们以含有苯环共轭的醛类为荧光母核，通过与含有两个酰肼基的肼类化合物的一端酰肼基反应得到目标探针，再通过目标探针的另一端酰肼基特异性地结合糖蛋白上氧化后的糖链，从而达到特异性地检测糖蛋白的目的。在这一过程中，我们首先需要考察该探针的母核结构与蛋白质的有无特异性结合。如果没有结合，说明该探针不会通过其它结构去结合蛋白质，从而极有可能通过一端的酰肼基特异性地去检测糖蛋白，因此可作为备选的荧光探针。　　2.在备选染料的荧光探针中，选取产率高、荧光强、毒性低、成本较低的荧光探针进行下一步考察。　　3.我们分别通过对混合的标准蛋白（同时含糖蛋白和非糖蛋白）以及分别从人血清、人成纤维细胞、小鼠心肌组织、小鼠肝脏组织提取的总蛋白样品来共同考察这种新建立的糖蛋白检测技术。　　4.首先，样品总蛋白经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离;分离后的凝胶置于一定比例的醇酸溶液中固定，用于除去影响下一步氧化效率的残留电泳液成分。　　5.糖蛋白检测大多数是根据经典席夫碱的原理，首先加入氧化剂够高效地将蛋白质上糖基的邻二羟基氧化成邻二醛基，再与含氨基、肼基或腙基的荧光探针结合。我们选用了多种常用的氧化剂，然后根据实验的需求从中筛选出具有水溶性好、毒性较低、氧化效率高，作用温和的氧化剂进行下一步实验，通过检测结果确定最佳的氧化条件。　　6.实验结果发现残留的氧化剂对检测结果影响非常之大，为了去除残留的氧化剂，我们需要筛选一种有效的且不会影响后续检测的还原剂。在选用的常用的还原剂中，根据实验的需求从中筛选出具有水溶性好、毒性较低、干扰少，进一步通过检测结果确定最佳的还原条件。　　7.样品处理完毕后，接着加入新合成的探针进行染色。该过程仍需筛选探针的溶剂外环境、染色浓度、染色时间，最终确定其最佳着色条件。　　8.经荧光探针染色后的凝胶上的糖蛋白，需要置于凝胶成像仪内成像，收集荧光信号。　　9.最后，采用糖蛋白的去糖基化酶(PNGase F)的去糖基化实验、凝集素富集实验、LC-MS/MS质谱实验，同时与其他使用的糖蛋白检测试剂盒进行对比，共同来考察这种新方法术的选择性、灵敏度和有效性。　　结果:　　1.从一系列合成的酰肼类荧光探针中，发现1-芘基碳酰肼(UGF202)，其在荧光、成本和检测特异性方面均优于其他备选染料。　　2.从双氧水、高锰酸钾、重铬酸钾、高碘酸(HIO4)等常用的氧化剂中，最终选择了高碘酸作为氧化剂并筛选出了最佳氧化条件。在室温条件下，高碘酸以较低的浓度在20分钟内将糖蛋白上的糖链部分高效率地开环氧化成邻二醛基，又可避免过度氧化。　　3.从常用的还原剂中，如硼酸氢钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸(VC)，确定了抗坏血酸作为最佳还原剂，其优点在于仅需5分钟即可中和凝胶上残留的高碘酸，而不会影响下一步荧光探针跟糖蛋白质的共价结合，又能通过抗坏血酸的颜色变化来判断高碘酸的去除情况。　　4.总结以上的实验结果，这种新建立的糖蛋白特异性检测方法的操作步骤如下:　　(1)经SDS-PAGE分离后，凝胶置于50％甲醇(MeOH)5％无水醋酸(HAc)的固定液中固定20分钟;　　(2)弃去固定液，加入1％高碘酸(HIO4)的水溶液氧化20分钟;　　(3)弃去氧化液，加入1％抗坏血酸(VC)水溶液还原5分钟;　　(4)弃去还原液，加入由0.001％ UGF202，5％氮氮二甲基甲酰胺(DMF)和40％乙醇(EtOH)组成的染色液，作用20分钟;　　(5)置于凝胶成像仪上成像。　　5.基于SDS-PAGE凝胶上糖蛋白的荧光检测，分别从灵敏度、选择性、检测时间以及检测成本的角度等去比较新建立UGF202的检测技术与Pro-QEmerald糖蛋白检测试剂盒:结果发现UGF202的检测灵敏度是Pro-QEmerald试剂盒的2-4倍，在检测特异性方面也略优于Pro-Q Emerald试剂盒，并且大幅度地缩短了检测时间，提高了检测效率。　　6.联合二向凝胶电泳分离技术和LC-MS/MS，共鉴定出19个糖蛋白，进一步验证了新方法的质谱兼容性、特异性和有效性。　　结论:本研究建立的凝胶上糖蛋白特异性检测新技术UGF202，检测限低至0.5-1 ng，步骤少，操作简便，是一种高灵敏、低成本、稳定的糖蛋白特异性检测技术。